阿尔巴斯绒山羊初级和次级毛囊细胞体外生长模型的建立及次级毛囊发育相关功能基因的筛选

通过分离酶和胶原酶消化以及显微镜下微手术分离技术，分离和培养内蒙古阿尔巴斯绒山羊初级、次级毛囊，以及毛囊来源细胞。通过检测毛囊的生长状态，细胞的生理生长指标，进一步优化其体外培养条件，建立体外毛囊和毛囊细胞的生长模型。分离毛囊干细胞，与毛囊细胞"共培养"以期稳定毛囊细胞的体外生长环境。建立和完善在细胞水平上检测毛囊特异表达载体的技术平台和标准。. 通过遴选具有优质羊绒生产性能的绒山羊个体，以正常的绒山羊个体和体外培养细胞为对照，对其皮肤样本进行平行的高通量转录组测序。通过生物信息学方法计算和分析实验数据，获得两个样本数字化的差异表达序列标签。结合分子生物学理论和我们建立的细胞模型检测，进一步验证这些差异表达基因的功能。为人工调控绒、毛生长提供研究基础。

内蒙古阿尔巴斯品系（Alpas）白绒山羊的羊绒由于其绒纤维细度好，柔软、洁白度高等优良品质，一直被国际上誉为“纤维宝石”和“软黄金”，具有很高的市场价值。若想提高此类优质羊绒的生产效益，首先需要弄清绒山羊绒、毛生长和发育的周期性规律及其内部的基因调控机制。为此，我们首先建立了绒山羊初级和次级毛囊不同类型细胞的体外生长模型（目前已包括：初级、次级毛乳头细胞、毛囊干细胞，以及真皮源性真皮鞘细胞、表皮源性外根鞘细胞等）；利用高通量测序技术，分别获得了来源于纯系白绒山羊个体的皮肤样本、初级和次级毛囊毛乳头细胞系不同生长时期的转录组测序结果。获得了生长期初、次级毛囊细胞的差异基因表达文库和差异表达基因1044个，以及生长期和休止期次级毛囊细胞基因差异表达的结果，获得差异表达基因共计825个。通过生物信息学比较和分析，发现这些基因明显富集于细胞周期、细胞黏附分子、细胞因子与细胞因子受体互作, 以及p53等信号通路中。在此基础上，我们选出一些重要的、与毛囊生长发育密切相关的一些细胞调控因子，先后构建完成了IGF1、Noggin、LEF1、Tß4、VEGF164、TCF4、FGF21、Casein Kinase Iε等外源性调控因子的转基因过表达载体或干扰载体，转染并分析了部分外源基因在毛乳头细胞中的表达和调控规律，成功制备了Tß4、VEGF164等转基因小鼠模型，进一步分析了这些外源性调控基因在模式动物体内的表达和作用规律。最后通过体细胞核移植技术获得了转Tß4、VEGF转基因绒山羊，在绒山羊体内初步验证了这些差异表达基因的调控作用。