分枝杆菌LAM脂多糖的不同聚糖结构对天然免疫反应的调节及分子机制研究

Lipoarabinomannan (LAM),as an unique composition of mycobacterial cell wall,plays an important role in host-recognition of pathogens. In this project,the hypothesis that the polysaccharides structure of LAM may impact the identification of toll-like receptor 2(TLR2) was put forward since LAM contributes to regulate innate immune responses. In previous studies, we have constructed six special M.smegmatis mc2155 mutation strains on the basis of glycosyltransferase-EmbC gene knock strain, the resulting molecule is different polysaccharides structure form of LAM (called as Δ LAM).In this study, intracellular replication of M.smegmatis mc2155 with differential polysaccharides structure could be measured using a luciferase-based method. The viability of macrophage upon infection is determined by means of macrophage phagocytosis test, measurement of reactive oxygen compounds and morphological change. In order to understand the interaction between polysaccharides structure of LAM and TLR2 triggering, Chinese hamster ovary (CHO) cell line with TLR2 gene stable expression was selected,the intensity of TLR2 triggering was measured through a significant NF-κB luciferase activity. To evaluate the regulation function of polysaccharides structure of LAM on innate immune responses,the expression changes of NF-κB signal pathway-related genes will be detected, furthermore three cytokines (IL-1β,IL-12 and TNF-α) induction in vitro were detected through ELASA. The results lay a good foundation for understanding immune evasion mechanisms and exploring novel anti-TB drug targets.

脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是结核分枝杆菌细胞壁特有的成分，在宿主对病原菌的识别中发挥重要作用。本项目以LAM调节TLR2介导的天然免疫反应研究为框架，提出LAM通过聚糖结构变化可以促进TLR2的识别和巨噬细胞活化的假想并加以证实。本实验室已经成功构建六种LAM聚糖结构变化的突变菌株，确认可以产生结构变异的LAM（ΔLAM）。本研究拟利用荧光标记和荧光素酶转化的突变菌株，通过巨噬细胞活力及细胞因子分泌的检测，明确聚糖结构与分枝杆菌在胞内生存的相关性。利用TLR2稳定转染的细胞株，定量分析ΔLAM与TLR2的相互作用，以确定具有不同聚糖结构的LAM对TLR2亲和力的差别。最后，利用人单核巨噬细胞系，通过检测ΔLAM对TLR2介导的信号途径相关分子及细胞因子分泌的影响，以揭示LAM中聚糖结构对天然免疫反应具有调节作用。研究结果为阐明分枝杆菌免疫逃逸机制和开发药物作用靶点奠定基础。

结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)是寄生于人体巨噬细胞内的胞内菌，也是引起结核病的主要致病菌。脂阿拉伯甘露聚糖 (lipoarabinomannan, LAM)是MTB细胞壁的独特结构，LAM在调节宿主与病原菌免疫反应方面发挥重要作用。结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶EmbC是LAM合成必须基因，MSMEG_6387是其同源基因。本课题以耻垢分枝杆菌为模式菌，利用基因敲除技术建立了MSMEG_6387基因敲除菌株。MSMEG_6387功能缺失产生结构变异的LAM。研究结果揭示，突变菌株菌体生长缓慢；细胞壁嗜酸染色缺乏；菌体形态发生明显改变，呈现菌体中间和末端膨出，所以，细胞壁LAM结构变化影响菌体细胞壁完整性。MSMEG_6387基因敲除菌株与野生型耻垢分枝杆菌菌株分别处理单核巨噬细胞，发现MSMEG_6387基因敲除增加了THP-1单核巨噬细胞的免疫活性，引起THP-1细胞NO释放增加，细胞因子IL-12以及TLR2表达增加；而细胞凋亡率则下降。 进一步，利用不同结构LAM处理THP-1细胞，细胞凋亡率呈现不同的变化趋势,但不同结构LAM对TLR2亲和力之间差异未见统计学意义。不同结构LAM与γ-INFR亲和力不同，所以，LAM结构变化可能是通过γ-INFR途径调节免疫细胞活力以及细胞凋亡。另外，在该项目研究过程中，我们发现另外一个可能的结核分枝杆菌致病因子—Rv3717，MSMEG_6281是其同源基因，我们也构建了MSMEG_6281基因功能缺失菌株，研究结果表明：MSMEG_6281基因与细胞壁分支菌酸合成相关。Rv3717蛋白具有酰胺酶活性，可以促进II型肺泡上皮细胞系A549对耻垢分枝杆菌的粘附作用。综上所述，LAM结构中阿拉伯糖含量降低能增强免疫细胞的活力并引起巨噬细胞凋亡，有可能的调节途径是γ-INFR途径。Rv3717为结合分枝杆菌重要致病基因，也可能是重要粘附分子。针对EmbC和Rv3717为靶点的药物开发和疫苗设计具有重要应用前景。