基于mdr1基因转录调控机制白血病细胞药物诱导性耐药的预防

肿瘤细胞耐药逆转至今未见临床成功应用的报道，将研究方向从耐药逆转转为耐药的预防可能是提高肿瘤疗效的一条新思路。本研究使用阿霉素在体内外分别作用于白血病敏感细胞株K562/S和HL-60/S，诱导白血病细胞耐药形成，建立耐药白血病细胞模型和耐药白血病裸鼠荷瘤模型。采用荧光定量RT-PCR、Western Blot、EMSA、RNA干扰、免疫共沉淀、基因转染、基因启动子活性检测等方法研究转录因子YB-1、NF-κB和AP1的表达水平、活化状态、三者之间的相互关系和相互作用，探讨三者所组成的mdr1基因调控网络在白血病细胞耐药形成中作用；使用汉防已甲素体内、外阻止白血病细胞在化疗药物阿霉素诱导下耐药基因和相关蛋白的表达，预防白血病细胞耐药性的产生，并且，比较汉防已甲素对白血病细胞MDR预防和逆转效果的差异。本研究将建立一个mdr1基因转录调控网络，对于阻止白血病细胞获得性MDR产生具有重大意义。

①采用梯度浓度阿霉素诱导的方法建立了慢性人红白血病细胞K562细胞的耐药株，并证实耐药性的存在。.②将K562细胞株接种于裸鼠背部皮下，建立裸鼠白血病荷瘤模型。采用低剂量阿霉素多次诱导法，在裸鼠体内形成诱导性耐药的移植瘤，建立白血病多药耐药裸鼠荷瘤模型。.③发现YB-1能明显增加白血病细胞抗药性，并在临床研究中得到证实。YB-1引起耐药的机制与其激活MAPK/ERK信号通路，YB-1蛋白的磷酸化、核易位，继而导致白血病细胞mdr1基因和相关P-gp表达增高有关，另外，YB-1可使白血病细胞的凋亡减少也是其引起耐药的原因之一。.④运用核酶和RNA干扰等技术特异性地下调VEGF及VEGF异构体基因的表达，证实VEGF自分泌作用在白血病细胞增殖和凋亡中的作用及与细胞药物耐受的关系；成功构建了含多药耐药相关蛋白1（mrp1）基因启动子的重组荧光素酶报告基因载体，在国内外首先证实VEGF对MRP1基因启动子活性具有上调作用。.⑤构建了特异性针对WT1基因异构体WT1/+17aa的小发夹RNA重组载体，下调白血病细胞WT1基因异构体WT1/+17aa，使细胞WT1/+17aa和WT1/-17aa的比例发生改变，细胞的耐药性下降。.⑥采用脂质体转染SiRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAd1Easy/YB1过表达YB-1，研究YB-1抑制三氧化二砷诱导人胃癌BGC-823细胞自噬的机制。结果显示，YB-1高表达组Bcl-2基因表达增高，Beclin1和Lc3-II蛋白减少，Bcl-2和P62蛋白增加，而YB-1低表达组Bcl-2基因表达水平降低，Beclin1基因表达在各组无明显差异；MDC染色结果显示，过表达YB-1自噬泡聚集减少，加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集，Beclin1蛋白恢复表达，P62降解增加，LC3II升高；YB-1可能通过上调Bcl-2从而抑制Beclin1，实现对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制。.⑦采用不同浓度的汉防己甲素预防K562细胞耐药发生，结果显示，阿霉素可诱导细胞mdr1mRNA、NF-κBmRNA、P-gp表达和P-gp功能的上调，汉防己甲素预作用24h后能显著抑制阿霉素诱导的耐药功能的上调。阿霉素作用组NF-κB mRNA和蛋白表达上调、c-jun mRNA和蛋白表达减低、survivin mRNA表达