农杆菌毒性蛋白VirE2和VirE3在转化过程中的生物学功能及相关分子机制研究

Agrobacterium tumefaciens has been widely used as the workhorse for the genetic engineering of plants and non-plant organisms. However, the molecular mechanisms of the transformation process remain poorly understood. Previously, we have built up a split–GFP based system to detect the Agrobacterium-delivered VirE2 inside recipient cells. This split-GFP approach allowed the visualization of VirE2 trafficking in the recipient cells in real time in a natural setting. Recently, we found that the VirE2 uses host endocytosis process for subcellular trafficking. Our preliminary work showed that VirE3 directly interacted with VirE2, suggesting that they may cooperate to facilitate the transformation process. In this project, the biological function and relative molecular mechanism of VirE2 and VirE3 during transformation will be further studied. In addition, we will also examine the important roles of host factors in the transformation process. Our study will shed light on the trafficking mechanism of bacteria-delivered proteins inside eukaryotic cells and benefit the further applications of Agrobacterium.

根癌农杆菌（农杆菌）作为转化工具在基因工程领域具有广泛应用，但其转化宿主细胞的分子机制仍有待进一步阐明。前期我们建立起了能够直接在宿主细胞内部追踪和研究农杆菌毒性蛋白的天然标记系统。在此基础上我们发现，农杆菌毒性蛋白VirE2能够利用宿主细胞的内吞作用进入到宿主细胞内部。后续研究表明，农杆菌毒性蛋白VirE3能与VirE2直接相互作用，提示毒性蛋白VirE2与VirE3可能相互协作并帮助农杆菌完成转化过程。在此基础上，本项目拟结合细胞与植物模型，明确毒性蛋白VirE2和VirE3在农杆菌转化过程中的生物学功能和分子机制；进一步阐明宿主细胞正常生理系统在农杆菌转化过程中所承担的作用。通过本项目的实施，有望阐明外源蛋白在真核细胞内部的运动模式和运动机制，并为后续农杆菌的转化应用奠定基础。

根癌农杆菌（农杆菌）作为转化工具在转基因技术与基因工程领域具有广泛应用，但其转化宿主细胞的分子机制仍有待进一步阐明。前期我们建立了能够直接在宿主细胞内部追踪和研究农杆菌毒性蛋白的天然标记系统。在此基础上，我们发现农杆菌的毒性蛋白VirE3蛋白结构中段具有一段保守性极高的α-螺旋簇，并能够借此与植物细胞的细胞膜相结合。其次，VirE3蛋白的氨基端具有自我互作的能力，在靶向植物细胞膜的同时，能够在农杆菌四型分泌系统和植物细胞接触区域形成紧密的锚定结构。最后，VirE3蛋白的羧基端能够直接与毒性蛋白VirE2相结合，将VirE2蛋白暂时锚定在宿主细胞的细胞膜上。这一机制能够高效地让VirE2停留在农杆菌四型分泌系统的开口处，从而提高VirE2与T-DNA在宿主细胞内的结合效率，并为T-DNA在对宿主细胞核的靶向运输过程中提供有效的保护机制。本项目结合细胞与植物模型，明确了农杆菌毒性蛋白VirE2和VirE3在农杆菌转化过程中的生物学功能和相互协作的分子机制，同时阐明了宿主细胞膜及核孔复合体结构在农杆菌转化过程中的生物学功能。通过本项目的实施，揭示了外源蛋白和核酸大分子在真核细胞内部组装和运动的分子机制，并为后续农杆菌的转化应用奠定了基础。