农杆菌蛋白VirE2在寄主细胞内定向转运的分子机制及其应用潜力研究

Proteins have a variety of superior properties, but the molecular weights are too large to directly penetrate the cell membranes. Because proteins cannot directly enter the cells to execute their functions, the usage of proteins has been limited by the delivery technology. How to effectively transfer proteins into the cells and use their functions is a major challenge for the biological and medical communities. An important measure to deal with this challenge is to explore the mechanism of how exogenous proteins are taken up and then trafficked inside the cells. Recently, we developed a split-GFP method that can directly visualize Agrobacterium-delivered VirE2 protein inside host cells, in real time. We found that the efficiency of VirE2 delivery into plant cells is up to 100%. We have established a unique model that can study the trafficking of exogenous protein inside cells in real-time in a natural setting. Using the molecular imaging technique, this project aims to explore molecular mechanisms of the intracellular trafficking of Agrobacterium-delivered VirE2 and the application potential: to study the roles of clathrin adapter proteins in the trafficking of VirE2 protein; to identify the VirE2 protein sequence responsible for evading the lysosomal degradation. This will help to open up new frontiers in molecular biology and develop novel techniques for protein transfer and drug delivery.

蛋白质有各种各样的优越性能，但分子量过大，不能直接渗透细胞膜，从而不能直接进入细胞展示其功能，极大地限制了蛋白质的更多实用性。如何有效地将蛋白质转入细胞并展示其功能是生物学和医学界所面临的重大挑战。应对这一挑战的重要措施，就是探索细胞运转外来蛋白的机制。最近，我们开发出了一种绿色荧光蛋白分割技术，能实时地检测到了由农杆菌运转到细胞内的VirE2蛋白质，发现其运转效率高达100%，建立了实时研究外来蛋白VirE2在细胞内运转情况的独特模型。本项目旨在通过这一分子影像技术，探索外来蛋白VirE2在细胞内定向运转的分子机理和应用潜力：研究网格蛋白衔接蛋白在VirE2蛋白运转中的作用；确定VirE2蛋白逃避溶酶体降解的信号片段。这将有助于开拓分子生物学的新前沿，开发蛋白质运转和药物输入的新型技术。

通过本团队创建的分子影像技术，我们发现植物网格蛋白衔接蛋白复合物1（AP1）对于VirE2在细胞质内的定向核运输很重要。拟南芥中有两个AP1同源物；一个AP1M2（AP1的μ2亚基）基因的插入突变大大减弱了农杆菌转化效率。体外下拉试验表明，AP1M2可以通过其mu同源结构域（MHD）与C端VirE2相互作用，该作用是通过以前显示与AP2相互作用的基于酪氨酸的排序基序进行的。实验表明，这种相互作用对VirE2转运和农杆菌转化效率很重要。我们的数据表明，从细菌传递到内在进入植物细胞后，VirE2从AP2传递到AP1，随后由AP1来主导VirE2在细胞质内的运转。 AP1是VirE2在细胞质内部向细胞核运输的必需物质。. 我们还发现，网格蛋白衔接蛋白AP3在农杆菌介导的植物转化过程中的起着重要作用。通过使用拟南芥根的肿瘤发生测定法，我们测试了编码拟南芥AP3复合物中的mu亚基的单拷贝基因AT1G56590的T-DNA插入突变体（zip4），发现AP3的敲除突变降低了农杆菌介导的转化效率。随后，我们用本氏烟草AP3 amiRNA敲低突变体，证明了AP3复合物在农杆菌介导的植物细胞转化中起重要作用。在研究分子机制过程中，我们发现AP3复合物的存在对于VirD2在转化过程中的功能很重要；并证明AP3复合物的缺陷会显着影响VirD2核靶向的效率。这表明，VirD2核靶向需要AP3复合物。但是，AP3复合物缺乏症不会影响VirE2在酵母细胞中的运转或宿主核蛋白histon 3的核靶向。因此，AP3复合物对VirD2核靶向的影响是具有特异性的。. 在探索该项目的应用潜力时，我们发现，VirE2-GFP分子追踪系统可以用来检测药物的副作用。整个系统采用的是植物细胞；用植物细胞来检测药物毒性将是一大重要创新。