基于分子改造的酰胺酶底物识别机理研究

Amidase plays an important role in the synthesis of chiral carboxylic acids and amide derivatives, which makes it one of the key enzymes in organic chemical production. In this project, an amidase from Rhodococcus erythropolis ZJB-09149, which has important prospect for industrial applications, will be used for fundamental studies, alongside halogen-substituted nicotinamides and halogen-substituted mandelamines as substrates. According to the steric sensitivity of amidase, molecular modification approach will be adopted to improve the amidase’s catalytic activity and stereoselectivity. The study of changes in catalytic activity and stereoselectivity caused by different mutation sites on amidase, could reveal the relationship between the enzyme structure and its effect on the catalytic activity and stereoselectivity. By that, it could pinpoint the amino acids participated in the catalysis, and further understanding of its structure-function relationship and substrate recognition mechanism. This subject aims to provide more insights on the catalytic mechanism of amidase and broaden its potential in terms of application.

酰胺酶是合成手性羧酸和酰胺衍生物的重要工具酶，在有机化学品合成中扮演重要的角色。本课题以具有重要工业应用前景的Rhodococcus erythropolis ZJB-09149酰胺酶为研究对象，以不同卤素取代的烟酰胺和扁桃酰胺衍生物为底物；针对酰胺酶位阻效应敏感性问题，通过分子改造获得催化活性和立体选择性提高的突变体，研究引起催化活性及立体选择性改变的酶分子结构基础，揭示酰胺酶不同突变位点对底物催化活性和立体选择性改变的影响规律；准确定位酰胺酶催化活性和立体选择性相关的氨基酸残基，确定酰胺酶结构与催化活性、立体选择性之间的关系，阐明酰胺酶催化的底物识别机制，为酰胺酶的分子适应性改造奠定基础，拓宽酰胺酶的应用潜力。

酰胺酶是合成手性羧酸和酰胺衍生物的重要工具酶，在有机化学品合成中扮演重要的角色。项目组通过酰胺酶菌株的选育和基因挖掘技术，依托不同氯取代的烟酰胺底物，筛选获得了对2-氯烟酰胺具有一定水解能力的重组酰胺酶Pa-Ami，对酶进行了分离纯化及酶学性质的表征；动力学研究表明，在2-氯烟酰胺、4-氯烟酰胺、5-氯烟酰胺、6-氯烟酰胺以及烟酰胺这五种底物中，对2-氯烟酰胺的活力最低，Vmax仅为18.9 μmolmg-1 min-1，kcat/Km为20.83 mM-1 min-1；对烟酰胺活力最高，Vmax可达178.6 μmol mg-1 min-1。这说明当吡啶环发生氯原子取代时会造成酶活的下降，尤其是氯原子取代发生在C-2位（即2-氯烟酰胺）时活力最低；利用饱和突变策略并结合分子对接技术对该酶进行了适应性改造，筛选获得了几株活力有较大提升的突变体：利用同源建模和分子对接等技术，以标签家族酰胺酶晶体结构2DC0为模板，构建了酰胺酶Pa-Ami的结构模型，通过分析设计了若干个可能影响其活力的氨基酸残基作为突变位点；构建了若干个定点饱和突变库，利用基于Fe3+变色反应的高通量筛选模型，从中筛选到了活力有明显提升的突变体G175A、S309H、S309Y、G175A/S309H以及G175A/S309Y。其中，活力最高的为单突变体G175A，其活力是野生型Pa-Ami的3.2倍；对单突变体G175A的动力学参数进行了测定，其对底物2-氯烟酰胺的Vmax和kcat/Km均提高了2倍左右；考察了突变体全细胞催化2-氯烟酰胺的反应进程，其对底物的水解反应时间较野生型大幅缩短，利用低温分批补料的方式，突变体G175A最终能够催化1100 mM的底物，2-氯烟酸产量为1055 mM，转化率达到95.9%；进一步通过生物信息学模拟、同源建模及对接分析，对突变体G175A进行了定向进化研究，构建了6000余个定点饱和突变库，利用饱和突变策略对该酶进行了适应性改造，获得了突变体V109L、I83V、L403V、M225L，其酶活（湿菌体）分别达到1026，1163，2145，1478Ug-1，其中突变体L403V的细胞酶活相比出发菌株提高了34%，并系统优化了全细胞催化酰胺底物催化合成羧酸的条件。