壳聚糖通过NF-κB信号通路调节奶牛抗氧化功能的机理研究

Regulating and increasing antioxidative function was an important measure to ebhance immune response and reduce mastitis incidence of early lactating cows. The nuclear factor nuclear factor-kappa B (NF-κB) is a redox-sensitive transcription factor that is new target of antioxidative effect. The program was conducted to elucidate the mechanism on chitosan regulating antioxidative function of milking cow in early lactation by using feeding trial according to milk performane, somatic cell count, immune parameter, the activity and their gene and protein expression in NF-κB signaling pathway, anti-oxidative enzyme, related downstream cytokines as well as NO production. The regulation of chitosan on oxidative injury induced by diethylene triamine-nitric oxide Polymer or lipopolysaccharide in peripheral blood mononuclear cell (PMBC) was discussed. Oxidative stress-induced PMBC was served as a model to discuss the regulation of chitosan on the transcription activity of NF-κB signaling pathway, gene expression including antioxidative enzyme，related cytokines and NO production via blocking NF-κB signaling pathway and siRNA-mediated NF-κBp65 gene silencing, discussing the mechanism for chitosan to regulate oxidative function of dairy cows via NF-κB-NO pathway.

提高奶牛的抗氧化功能是增强免疫应答、降低乳房炎等炎性疾病发生的重要措施。核因子-κB (NF-κB)是一个对氧化还原反应敏感的转录因子和抗氧化作用的新靶点。项目将产奶性能、体细胞数、免疫指标、NF-κB信号通路、抗氧化酶、下游细胞因子的释放与NO的生成相结合，利用体内法研究了壳聚糖对泌乳前期高产奶牛抗氧化功能的影响及其机理。以奶牛外周血单个核细胞(PMBC)为模型，研究了壳聚糖对二乙烯三胺/一氧化氮聚合物或脂多糖诱导的细胞氧化损伤的保护作用；以诱导损伤的PMBC为模型，通过对NF-κB信号通路进行阻断和siRNA沉默基因NF-κBp65，研究了壳聚糖对NF-κB信号通路的转录活性、抗氧化酶、下游相关细胞因子的基因与蛋白质的表达及NO生成的调节作用，以及NF-κB信号通路的活性对IL-1和NO生成相关基因的调节作用，从NF-κB-IL-NO途径探讨了壳聚糖对奶牛抗氧化功能的调节机理。

奶牛在泌乳过程中由于高的代谢水平，通常伴随着一氧化氮（NO）等自由基类代谢产物的增加，加剧了炎症反应，奶牛引起产奶性能和乳品质的。壳聚糖具有抗氧化、抗炎等生物学活性，但极其有限的资料报道了壳聚糖对奶牛抗氧化与免疫功能的调节作用，其影响机理也尚不清楚。本项目利用体内试验研究了日粮添加壳聚糖对奶牛产奶性能、抗氧化功能和抗炎症反应的调节作用，并结合体外法以外周血单个核细胞（PBMCs）为模型、通过NO和脂多糖（LPS）诱导PBMCs的氧化损伤，通过拮抗IL-1的受体、阻断NF-κB信号通路和siRNA沉默基因NF-κBp65，从NF-κB/IL-1/NO途径诠释了壳聚糖对奶牛抗氧化功能的调节机理。结果表明日粮添加壳聚糖促进了奶牛的产奶性能、抗氧化功能和抗炎症反应，降低了血清NO含量及PBMCs中NF-κBp65的蛋白磷酸化水平和iNOS活性，以1500mg/kg的壳聚糖效果较好。饲喂壳聚糖的奶牛PBMCs对LPS诱导的氧化损伤具有剂量依赖性的减缓效果，逆转了LPS引起的细胞抗氧化和抗炎反应的下降，降低了NO生成；没有饲喂壳聚糖的奶牛PBMCs 则无上述效果。体外研究进一步验证了与壳聚糖具有类似生物学功能的壳寡糖（COS）对由NO和LPS诱导的氧化损伤具有剂量依赖性的保护作用，可提高PBMCs的抗氧化能力，降低炎症因子、iNOS活性和NF-κBp65蛋白磷酸化水平，抑制NF-κB通路活性，以160μg/mL效果较好。LPS通过激活NF-κB通路活性促进了其下游因子IL-1的释放，介导iNOS的表达和NO的生成；COS通过抑制NF-κB信号通路活性，降低了IL-1的活性，下调了IL-1介导的iNOS的基因表达与NO的生成，促进了GPx等抗氧化酶活性的显著升高，进而对氧化损伤的细胞起到减缓作用。过量NO生成是诱导奶牛氧化应激的标志性代谢物；NF-κBp65是壳聚糖调节奶牛抗氧化能力的关键基因。项目从NF-κBp65/IL-1/NO途径诠释了壳聚糖促进奶牛抗氧化应激能力、降低炎症反应的机制；即壳聚糖通过抑制NF-κB通路降低了IL-1 介导的iNOS的基因与蛋白质表达，降低了NO的过量生成，促进了奶牛的抗氧化功能与抗炎症反应。项目的完成对丰富奶牛氧化损伤和抗氧化应激理论、有效降低因氧化应激在奶牛生产中造成的负面影响具有重要的理论与实际意义。