NF-κB信号通路调控S.aureus感染奶牛PMN凋亡机制的研究

奶牛金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）乳腺炎是严重危害奶牛业的重要疾病，嗜中性粒细胞（Polymorphonuclear leukocyte, PMN）的凋亡是决定乳腺炎症程度的关键，受信号转导通路调控，NF-κB是多条信号转导通路的交汇点。但NF-κB相关信号通路如何调控S. aureus乳腺感染中PMN的凋亡等问题尚无答案。本研究利用S. aureus感染奶牛PMN的体外模型，以PMN凋亡为核心，抓住NF-κB信号转导通路的重要环节，通过信号通路抑制剂、免疫印迹、流式细胞术、电泳迁移率变动分析、激光扫描共聚焦显微技术等，从整体、细胞和分子水平解析NF-κB信号转导途径调控S. aureus 感染奶牛PMN凋亡的机制，为阐明奶牛S. aureus 感染致乳腺损伤的机理提供理论依据，为寻找新型干预乳腺炎症的药物靶标奠定理论基础。

奶牛乳腺炎是世界范围内影响奶牛业最大的疾病，在众多能引起奶牛乳腺炎的病原中，S. aureus的危害最为严重。由于抗生素的滥用和疫苗的缺乏导致乳腺炎的防治非常困难，探索S. aureus乳腺炎发生、发展与转归的分子机制迫在眉睫。中性粒细胞是奶牛乳腺抵御病原菌侵袭的第一道防线，它的凋亡对于控制乳腺炎症的发展和转归及解除奶牛不良炎性反应发挥重要作用。为解析奶牛S. aureus乳腺炎发生时中性粒细胞凋亡的分子机制及相关NF-κB 信号通路，本研究在体外37℃，5% CO2的条件下培养从奶牛外周血中分离到的中性粒细胞，向培养基中以50：1的比例加入处于对数生长期的S. aureus，分别在共培养0h，2h，4h，6h，8h，10h后用FITC/PI双染法通过流式细胞术检测中性粒细胞凋亡情况，随后利用基因芯片技术筛选出与中性粒细胞凋亡及NF-κB 信号通路相关基因，并通过qPCR对所得结果加以验证。实验结果显示：（1）S. aureus诱导中性粒细胞凋亡情况：在第0h，2h，4h，6h，8h和10h检测中性粒细胞凋亡，实验组细胞凋亡率相比于对照组均存在极显著差异，差异值分别为3.31%，4.63%，6.77%，8.83%，8.12%和6.35%，其中诱导时间为6h时凋亡率差异最大。（2）基因芯片结果显示，共有206个基因上调表达，357个基因下调表达：与凋亡相关的差异表达基因共有4个，其中上调表达的为Bcl-2，它的上调表达倍数为2.4847；下调表达的有IL1-α，IL1-β和IL1-R1，下调表达倍数分别为0.2125，0.2062和0.3082。（3）NF-κB 信号通路调控相关B 细胞编码κ轻链多肽抑制基因（IKBKG）表达水平显著下调。通过以上研究得到如下结论：（1）S. aureus能够诱导体外培养的中性粒细胞凋亡，而且在10h的诱导时间内凋亡率的变化是极显著的；（2）调控中性粒细胞凋亡的基因主要为原癌基因Bcl-2，IL1及其受体。（3）NF-κB 信号通路的调控与IKBKG基因的下调密切相关。