PRAS40蛋白在脑缺血-再灌注损伤中的作用机制研究

The proline-rich Akt substrate of 40 kDa(PRAS40) protein is not only a substrate of Akt, but also an important component of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), thus, PRAS40 serves as a linker between Akt and mTOR pathways. In our previous works, we have found that Akt and mTOR pathways are related with the brain ischemia and reperfusion injury and overexpress PRAS will contribute the protective effect against stroke. According to these findings, in this study we first plan to observe if the deletion of PRAS40 protein will aggravate the brain ischemia and reperfusion related injury in rats in vivo, and worsen the injury of primary mixed neuron culture by OGD in vivo. Secondly, we try to find the possibly mechanism how PRAS40 affect the brain ischemia and reperfusion related injury(through Akt/mTOR pathway, ROS, cell apoptosis). At last, we will use the lentiviral vector of PRAS0 constructed already, to overexpress PRAS40 both in mixed neuron culture and in cortex of the rat brain, to see if it will abolish the effect of PRAS40 protein deletion and attenuate the brain ischemia and reperfusion related injury. Through this study, we hope to understand the important role of PRAS40 protein in brain ischemia, and offer a potential therapy target for brain ischemia in clinic. PRAS40

PRAS40作为Akt的下游分子，同时可与mTOR复合物结合。在我们前期工作中已证实Akt和mTOR通路均与脑缺血-再灌注损伤有关。而PRAS40可直接与两条通路发生作用，因此推测其在脑缺血-再灌注损伤中起到重要作用。基于这个假设，本研究将在前期工作证实PRAS40过表达对脑缺血-再灌注损伤起到保护作用的基础上，首先观察PRAS40蛋白缺失后是否加重大鼠体内脑缺血-再灌注损伤；体外是否增加糖氧夺获（OGD）所致原代混合培养神经元的损伤；其次明确可能的作用机制（影响Akt及mTOR通路、氧自由基的清除、细胞凋亡）；最后，应用已构建的PRAS40慢病毒载体，使其在PRAS40蛋白缺失大鼠脑皮层及原代混合培养神经元中表达PRAS40，观察是否可抵消PRAS40蛋白缺失的影响，缩小脑梗死面积、减轻损伤。通过本研究，期望明确PRAS40蛋白在脑缺血-再灌注损伤中所起的作用及机制。

PRAS40作为Akt通路的下游分子，同时可与mTOR复合物结合。在我们前期工作中已证实Akt和mTOR通路均与脑缺血-再灌注损伤有关。而PRAS40可直接与两条通路发生作用，因此推测其在脑缺血-再灌注损伤中起到重要作用。基于这个假设，本研究做了以下几部分工作:（1）明确PRAS40参与脑缺血-再灌注损伤过程，并通过构建PRAS40过表达慢病毒载体，在体内外证实PRAS40过表达对脑缺血-再灌注损伤起到保护作用。（2）在上述实验基础上，应用PRAS40缺失的转基因小鼠，发现急性期PRAS40蛋白缺失小鼠（PRAS40-/-）正常WT（PRAS40+/+）小鼠增加脑梗死的面积；同时PRAS40蛋白缺失可加重体外原代培养神经元细胞损伤。（3）进一步机制研究发现，PRAS40-/-小鼠与WT小鼠在缺血后5小时均可上调p-Akt表达，但WT小鼠在缺血后24小时及48小时仍可上调Akt上游分子p-PTEN表达，提示通过Akt上游分子启动相关缺血保护机制，而PRAS40-/-小鼠则丧失了上调p-PTEN的能力；同时在mTOR通路中，与PRAS40-/-小鼠相比，WT小鼠在缺血后5小及24小时可显著上调p-P70S6K与p-S6的表达。免疫共沉淀实验揭示PRAS40蛋白缺失可抑制Akt/mTOR相互作用，阻断了Akt-mTOR通路。均说明PRAS40蛋白的缺失可阻止Akt及mTOR相关分子的磷酸化及两条通路间的相互作用，从而加重缺血损伤。同时p53基因可能与PRAS40调控机制有关。（4）通过PRAS40过表达慢病毒载体将PRAS40基因重新导入PRAS40-/-小鼠体内及体外原代混合培养神经元细胞，使其在PRAS40蛋白缺失小鼠脑皮层及原代混合培养神经元中表达PRAS40，发现可抵消PRAS40蛋白缺失所造成的后果，明显减轻体外原代混合培养神经元细胞损伤，并缩小PRAS40-/-小鼠脑缺血后梗死面积。通过本研究，明确PRAS40蛋白作为连接Akt及mTOR通路的重要分子，在脑缺血-再灌注损伤中起到重要作用，其过表达可产生保护效应，而该蛋白缺失则通过抑制Akt-mTOR通路加重损伤，为临床脑缺血相关疾病治疗提供新的潜在治疗靶点及科学依据。