p53-PRAS40-mTOR通路对脑缺血-再灌注损伤的调控作用及机制研究

p53 is an important molecule related with cerebral ischemia-reperfusion injury, and its mechanism remains unclear. Our previous works show that p53 regulates the OGD-induced injury in primary neuronal cultures, which is related with PRAS40 and mTOR pathway. Thus we hypothesized that p53, as a key factor in regulating stress, may affect the mTOR pathway by directly regulating the transcription of PRAS40 gene, then participate the process of cerebral ischemia-reperfusion injury. Autophagy may be another important mechanism. To confirm the hypothesis, we will use p53-associated lentivirus and p53 neuron-specific knockout mice (p53-N-KO) to study the role of p53 against ischemia in vivo and in vitro, and to determine if such effects come through mTOR pathway; Then we used PRAS40 KO mice to further observe if PRAS40 deletion will cause the absence of p53 regulation against cerebral ischemia, and in vitro transfection are also used to confirm PRAS40 is one of the direct transcriptional targets of p53; finally we detect the function of p53-PRAS40-mTOR pathway on regulating the neuronal autophagy. In this project, we use transgenic animals, cells and lentivirus vectors to find out the important effects and mechanism of novel p53-PRAS40-mTOR signaling pathway against in cerebral ischemia - reperfusion injury, which will provide the new basis and ideas for clinical treatment of cerebral ischemia.

p53调控脑缺血再灌注损伤的机制始终未明确。我们前期工作已在体外证实p53可通过mTOR通路调控神经元OGD损伤，且与脑缺血损伤时的重要调控因子PRAS40蛋白关系密切。因而我们提出p53可能通过对PRAS40的直接转录调控影响mTOR通路活性，从而参与脑缺血损伤的假说。为此本课题首先应用p53相关慢病毒载体及p53基因神经元特异敲除小鼠在体内外确认p53对脑缺血损伤的调控作用，并证实该作用通过mTOR通路而产生；进一步应用PRAS40基因敲除小鼠，结合系列实验证实PRAS40是p53的直接转录调控靶点，介导p53-mTOR对脑缺血损伤的调控作用。最后观察p53-PRAS40-mTOR对缺血后神经元自噬的影响。本课题应用转基因动物、细胞、慢病毒载体等多种手段证实三者的关联，期望阐明p53-PRAS40-mTOR这一新信号通路在脑缺血调控中的机制，为脑缺血的临床治疗提供新的依据和思路。

p53是与脑缺血-再灌注损伤有关的信号分子，并且调控作用可能与PRAS40及mTOR有关，但具体机制始终不清楚。本研究在前期研究基础上，首先确认了p53基因通过mTOR通路对脑缺血-再灌注损伤的调控作用：第一部分中应用相关慢病毒载体及p53基因敲除小鼠（p53-/+及p53-/-）发现体内外p53基因过表达或抑制可加重或减轻动物脑缺血损伤；p53基因敲除对小鼠体外培养神经元的OGD损伤具有保护作用；同时，p53基因敲除小鼠可在急性期较WT小鼠减小MCAO后梗死区面积、减少细胞凋亡并改善神经行为学评分；而p53载体重新转染可抵消p53基因缺失而产生的保护作用；第二部分中发现p53基因调控作用与mTOR通路有关：体内外实验发现p53基因敲除后可显著提高体内外神经元mTOR通路磷酸化表达水平；激活体外培养神经元mTOR通路可抵消p53过表达后产生的加重神经元OGD损伤的作用，反之则可抵消其保护作用。第二，发现PRAS40可能是p53的直接转录调控靶点：第三部分中观察到p53基因敲除对小鼠脑缺血损伤的保护作用与增加PRAS40磷酸化表达有关； PRAS40的抑制可使得p53基因敲除后无法增加小鼠神经元mTOR通路的磷酸化水平；应用PRAS-/-小鼠行体外神经元培养，发现PRAS40缺失后p53过表达无法加重体外培养神经元OGD损伤；相反地，抑制p53表达也无法产生保护作用；此外， PRAS40基因敲除小鼠中p53表达水平较野生型（WT）小鼠明显增高；通过in silico生物信息学分析，在PRAS40基因启动子区域存在p53反应作用原件。这些结果提示PRAS40很可能是p53转录调控靶点，介导p53-mTOR通路对脑缺血损伤的调控作用。第三，揭示自噬在p53-PRAS40-mTOR通路对脑缺血-再灌注损伤的调控中起到重要作用：第四部分中应用免疫组化、Western blot等手段发现体内实验中p53基因敲除对小鼠脑缺血损伤的保护作用与减少神经元自噬有关；体外实验发现PRAS40的抑制可使得p53基因敲除后产生的减少神经元自噬作用消失，从而丧失了对OGD损伤的保护作用。本课题应用转基因动物、细胞、慢病毒载体等多种手段证实p53-PRAS40-mTOR三者的关联，阐明这一全新信号通路在脑缺血调控中的机制，为脑缺血的临床治疗提供新的依据和思路。