库氏鞘丝藻(Lyngbya kuetzingii)倍半萜合成酶基因的鉴定与表达分析

水体异味问题已在世界范围内普遍存在，由于该问题突发性强、影响范围广，已成为关系民生的重要问题之一。土霉味是淡水水体中最常见且最难以去除的异味，通常由化合物geosmin和2-methylisoborneol所引起，蓝藻是其主要生物来源。本研究拟从产geosmin蓝藻- - 库氏鞘丝藻(Lyngbya kuetzingii)中克隆、分离与geosmin生物合成密切相关的倍半萜合成酶基因，构建其原核表达体系，确定目的蛋白功能，从分子水平揭示蓝藻geosmin生物合成的关键调控因子。在此基础上，研究环境因子(温度、光强)调控目的基因表达的规律，阐释环境因子(温度、光强)对蓝藻geosmin产率影响的分子生物学机制，为水体异味防治技术的研究开辟新途径。

水体异味问题已在世界范围内普遍存在，由于该问题突发性强、影响范围广，已成为关系民生的重要问题之一。土霉味是淡水水体中最常见且最难以去除的异味，通常由化合物geosmin和2-MIB所引起，蓝藻是其主要生物来源。本研究以产geosmin蓝藻——库氏鞘丝藻(Lyngbya kuetzingii)为研究对象，首先，采用普通PCR和巢氏PCR技术从其基因组DNA中扩增出决定geosmin生物合成的geosmin合成酶基因geoL(NCBI数据库登录号：JX962775)。碱基序列分析表明，该基因包含一个长为2,298bp编码765个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明，geoL基因表达产物与颤藻(Oscillatoria sp.PCC6506)、眉藻(Calothrix sp.PCC7507)、乌克兰鱼腥藻(Anabaena ucrainica CHAB2155、A. ucrainica CHAB1432)、点状念珠藻(Nostoc punctiforme PCC73102)、席藻(Phormidium sp.P2r)、大型柱胞藻(Cylindrospermum stagnale PCC7417)geosmin合成酶同源性均在83%以上，与粘细菌的同源性介于61%~73%之间，与放线菌的同源性相对最低。geoL基因表达产物具有两个结构域，且每个结构域包含两个完全保守的镁离子结合基因序列，即天冬氨酸富集区和NSE三联体。上述结果表明，本研究在库氏鞘丝藻中成功获得与预期相符的负责geosmin生物合成的基因序列。之后，将geoL基因克隆至pET21a(+)表达载体上，并用IPTG诱导表达于E.coliBL21(DE3)中，SDS-PAGE显示目的GEOL蛋白在37oC和16oC诱导表达条件下均有明显可溶表达。对目的GEOL蛋白进行Chelating-SFF(Ni)亲和层析，得到含有His标签的融合蛋白，SDS-PAGE显示GEOL蛋白的分子量大小约为90kDa，与预测分子量87046Da大小相符。但透析后进行蛋白稳定性测试，结果显示该蛋白稳定性差、得率低。最后，将库氏鞘丝藻分别培养于不同温度(10、25、35oC)和不同光照强度(0、10、20、75μmolm-2s-1)下，结果显示其geosmin产率最高值出现在低温(10oC)和弱光(10μmolm-2s-1)条件下。