抑制Clusterin基因表达对耳蜗外毛细胞保护作用的研究

Majority of hearing loss is caused by damage and loss of hair cells in the inner ear. Hair cells, especially outer hair cells, one of the two types of sensory receptor cells in the cochlea, are vulnerable to ototoxic drugs and noise. Since the molecular mechanism(s) of such vulnerability are unclear, no effective treatment and prevention are available. In our hair cell-specific transcriptomic analyses we discovered that Clu, a gene encoding the transcription factor Clusterin, which is known to play an important role in the onset and progression of several neuronal degenerative disorders such as thealzheimer’s disease, is differentially expressed in outer hair cells. When we inhibited the expression of Clu in the cultured organ of Corti from mice, gentamycin-induced hair cell loss was significantly reduced. In this application, we propose to use a battery of electrophysiological, imaging, immunocytochemical and molecular biological techniques to discern the molecular mechanisms of ototoxic drug-induced hair cell apoptosis. More importantly, we will explore the possibility of treating/preventing ototoxic drug-induced hair cell apoptosis by inhibiting the expression of Clu with administration of antisense oligonucleotidesin the cultured organ of Corti and in the cochlea of adult mice. Our proposed research will have a significant impact on fundamental understanding of hair cell apoptosis and its regulatory networks. It will also lay the groundwork for designing drugs for treating/preventing ototoxic drug-induced deafness.

多种因素(噪声、耳毒性药物、衰老)均可造成耳蜗毛细胞凋亡从而导致永久性听力损失，目前尚无有效干预手段。同时，外毛细胞比内毛细胞对损伤更加敏感，其机制目前仍不清楚。在前期工作中我们发现，与细胞凋亡密切相关的基因Clustrein（Clu），在正常外毛细胞中特异性高表达，在衰老及Prestin基因敲除小鼠毛细胞中，其表达明显升高，并在培养组织中初步观察到抑制Clu对毛细胞的保护作用。本课题拟釆用电生理、免疫组化及分子生物学手段，研究链霉素造成毛细胞凋亡过程中，Clu表达量增高的时间变化规律及其在内外毛细胞中的变化差异，以及使用特异性反义寡聚核苷酸（AON）抑制Clu基因表达对链霉素所致毛细胞凋亡及小鼠听力的保护作用，这将有可能阐明导致毛细胞凋亡的一个新的调控机制。同时，由于临床试验中已有针对Clu基因的AON应用，本课题的确切结果将为分子药物在预防、早期干预及治疗药物性聋中的应用提供可能。

多种因素(噪声、耳毒性药物、衰老)均可造成耳蜗毛细胞凋亡从而导致永久性听力损失，目前尚无有效干预手段。同时，外毛细胞比内毛细胞对损伤更加敏感，其机制目前仍不清楚。在前期工作中我们发现，与细胞凋亡密切相关的基因Clustrein（Clu），在正常外毛细胞中特异性高表达，在衰老及Prestin基因敲除小鼠毛细胞中，其表达明显升高，并在培养组织中初步观察到抑制Clu对毛细胞的保护作用。本研究通过CRISPR/Cas9技术构建Clu基因缺陷小鼠模型。根据Clu基因组结构和蛋白功能保守区，Clu有多个转录产物。选取最长的转录本Clu-201进行设计，其中 Exon3（aa32-81）是公共外显子，位于蛋白保守功能区Clusterin，且所包含的碱基数目不是3的倍数，删除这个外显子后，造成移码突变，将破坏功能保守区Clusterin，蛋白失活，产生新的表型。实现将Clu基因敲除。在野生型（WT）小鼠和Clu基因knock-out纯合子小鼠的新生小鼠基底膜培养体系中分别加入半致死量庆大霉素，培养48小时后，应用免疫荧光染色观察毛细胞数量的变化差异。在衰老的过程中，应用TDT检测WT和Clu基因knock-out纯合子小鼠在不同年龄段（2个月、4个月、6个月和9个月）听力（ABR阈值）、畸变耳声发射，应用免疫荧光染色观察两者间基底膜形态改变。本研究通过体外和在体实验证明了抑制clu基因表达对毛细胞据有保护作用。本研究进一步拟采用特异的反义寡聚核苷酸（AON）来抑制 Clu 基因表达。如果实验效果确切，本课题将揭示导致毛细胞凋亡发生的一个新的调控机制，并为分子药物在预防及早期干预、治疗药物性聋中的应用提供可能,同时也对预防和治疗噪声性及老年性耳聋同样具有重要意义。