锌指蛋白人工转录因子（ZF-ATF）的构建及对耳蜗毛细胞保护作用的实验研究

感音神经性聋是最常见的听觉残疾，内耳毛细胞和/或螺旋神经节细胞的凋亡坏死是其发生的病理机制。研究发现锌指蛋白A20可抑制不同细胞因子诱导的细胞毒作用及凋亡的发生，维持细胞稳态，我们的前期研究提示A20可明显抑制耳毒性药物对毛细胞的损伤，因此激活毛细胞内源性A20基因表达是防治感音神经性聋的新策略。本课题将构建具有自主知识产权A20基因的人工锌指蛋白转录因子（ZF-ATF），在此基础上，将构建的ZF-ATF 聚乙二醇（PEG）化，达到增强其稳定性的目的；将PEG-ZF-ATF作用于离体、在体毛细胞损伤模型，通过检测毛细胞自身、听功能的改变以及突触前膜囊泡总体量、突触前囊泡释放的速度和彻底度、突触间钙信号、相关蛋白的表达变化，最终构建具有听功能保护作用的ZF-ATF，同时明确ZF-ATF对听功能可能的保护机制。可望为感音神经性聋的治疗提供一条新的途径。

感音神经性聋是最常见的听觉残疾，内耳毛细胞和/或螺旋神经节细胞的凋亡坏死是其发生的病理机制。研究发现锌指蛋白A20可抑制不同细胞因子诱导的细胞毒作用及凋亡的发生，维持细胞稳态，我们的前期研究提示A20可明显抑制耳毒性药物对毛细胞的损伤，因此激活毛细胞内源性A20基因表达是防治感音神经性聋的新策略。因此本课题试构建具有自主知识产权A20基因的人工锌指蛋白转录因子（ZF-ATF），在此基础上，将ZF-ATF作用于离体、在体毛细胞损伤模型，通过检测毛细胞自身、听功能的改变以及突触前膜囊泡总体量、突触间钙信号、相关蛋白的表达变化，明确ZF-ATF对听功能可能的保护机制。在本次研究中，我们得到了以下结论：（1）成功获取了ZF-ATF：利用生物信息学技术,分析A20基因结构,确定ZFP在A20基因上游启动子区的结合靶点。并以此靶点为基础设计相应的锌指多肽，在所设计的多条锌指多肽中选择最优化的多肽序列。利用不同的生物软件分析多肽序列，以获得最优化的相应DNA序列。以ZFP核酸序列为DNA结合域，以NF-κB的P65结构域为激活域，构建完整的ZF-ATF；将上述构建的人工转录因子ZF-ATF克隆到酵母表达载体pPIC9K。将ZF-ATF- pPIC9K通过电穿孔法转化毕节酵母GS115，并用PCR技术检测转化子。通过G418抗性筛选高拷贝整合的转化子。发酵后破碎酵母并抽提蛋白，过柱后得到纯化蛋白。（2）内毛细胞电生理检测：内毛细胞是将声信号转化为电信号的重要部分，它不同于外毛细胞，它的电生理特性是许多疾病病理改变的基础。目前外毛细胞已有基本电生理数据，但内毛细胞由于技术手段的限制，至今没有一套完整的数据，通过我们的研究首次获得了内毛细胞基本电生理数据，钙通道在-30 mV开放，峰值在0 Mv,反向钙通道在22-25 mV，钠通道在-30 mV开放，峰值在-20 Mv，这必将为揭示许多疾病的病理改变带来突破性进展。（3）通过验证病理模型来解释疾病发生的机制：目前越来越多的药物可以引起听力损伤，近年来调查发现长期服用对乙酰氨基酚或含有对乙酰氨基酚的药物制品，或枸橼酸西地那非（Sildenafil citrate，万艾可）能不同程度的引起听力损伤。但发生损伤的机制并不十分清楚，我们已经建立起药物损伤模型，并且掌握了损伤剂量，目前正在进一步研究损伤是否引起听觉突触以及毛细胞的改变。