P311促进烧伤创面表皮干细胞迁移及机制研究

表皮干细胞（ESC）的迁移是启动烧创伤后皮肤创面再上皮化与愈合的关键环节。我们前期研究发现，功能未知基因P311在烧伤后ESC中表达显著增加，并可促进HaCaT细胞的迁移。结合文献报道我们推测：烧伤后表皮干细胞高表达P311而活化Rac1等Rho GTP酶，后者作用于Src、PI3K、P2AK、c-Myc等下游信号分子使肌动蛋白为主的细胞骨架重排、促进表皮干细胞的迁移，最终促进皮肤创面修复。为此，本项目拟首先通过基因点突变、强制性高表达等明确P311对ESC迁移的影响；通过细胞骨架、相关信号基因、蛋白及活性水平等变化的检测，siRNA及特异性抑制剂等的应用、免疫共沉淀与质谱分析联合应用等探讨P311促进ESC迁移的可能机制；最后通过在体实验验证烧伤后P311通过促进ESC迁移而促进创面愈合的生物学作用。本课题的完成将有助于进一步丰富皮肤创面愈合机理，为创面修复调控提供新的方向与策略。

烧伤是以皮肤损伤为始发因素的特殊类型创伤，其主要问题是创面问题，如何尽早有效修复封闭暴露的创面是烧伤治疗的根本任务。本课题结合前期研究发现，探索P311对创面愈合的影响及作用机制。本课题成功构建了C57BL/6成年雄性小鼠皮肤浅二度烧伤模型及P311腺病毒载体及其突变体，分离、鉴定并扩增了人和小鼠表皮干细胞，检测P311对表皮干细胞的迁移能力及其机制。实验发现：烧伤早期创面和新生的表皮细胞中，P311表达增高，利用BrdU标记表皮干细胞，发现烧伤早期BrdU和P311共表达于新生的表皮干细胞中。运用Ⅳ型胶原快速黏附法成功分离培养了人表皮干细胞，分离培养的细胞中表皮干细胞标记物K19、整合素β1呈强阳性表达。利用基因点突变技术，构建了野生及157位点突变型P311腺病毒载体，并成功转染人表皮干细胞。在体外细胞迁移实验模型（划痕实验）中，发现Ad-Myc-P311、Ad-Myc-P311MA组表皮干细胞迁移能力在划痕后24h较空载和Ad-Myc-P311MD明显增强。激光共聚焦检测细胞骨架（F-actin）显示Ad-Myc-P311、Ad-Myc-P311MA组较空载组细胞伪足数量及长度增加，而Ad-Myc-P311MD组无明显变化。Pulldown检测发现，Ad-Myc-P311、Ad-Myc-P311MA较空载和Ad-Myc-P311MD组RhoA、Rac1、Cdc42活性明显增高。最后，应用分离培养的P311WT和KO新生小鼠表皮干细胞，进行体外迁移模型，发现P311敲除后，表皮干细胞迁移能力明显下降，划痕24h迁移距离降低了184.7μm。同时Pulldown实验发现P311KO组较WT组表皮干细胞RhoA、Rac1、Cdc42活性分别降低了49.6%、78.6%、69.8%。本课题研究初步阐明了“烧伤后表皮干细胞高表达P311--- RhoA、Rac1、Cdc42等RhoGTPease活化---肌动蛋白为主的细胞骨架重排---促进表皮干细胞迁移---促进皮肤创面愈合”这一理论机制，为创面愈合理论的调控提供了新的理论基础与线索，为下一步促进创面愈合药物的研发奠定基础。.至今，本课题已有6篇论文在国内外期刊发表，其中SCI论文4篇，中文论著2篇，参加国际及国内学术会议各一次。