烧伤后一氧化氮促使表皮干细胞脱粘附离巢的作用及机制研究

表皮干细胞(ESC)通过整合素等锚定于特定巢穴中，其脱粘附离巢是启动烧创伤创面再上皮化的关键步骤，但其机制并不清楚。研究表明，烧伤早期局部如ESC等多种细胞均可产生一氧化氮(NO)。我们自己近期及部分文献研究发现，NO可促进Rho GTP酶的表达与活化，活化的Rho GTP酶可使多种细胞细胞骨架及整合素发生重排或活化，继而影响细胞的粘附迁移功能。所以，烧伤后NO可能通过促使ESC脱粘附离巢启动创面再上皮化，从而在创面再上皮化中起着重要作用。由此，我们提出"烧伤- - NO- - Rho GTP酶- - 整合素/细胞骨架- - ESC脱粘附离巢- - 启动创面上皮化过程"的假说。本课题拟通过体外及体内实验，应用BrdU及3H-TdR双标记、Pull-down、RNA干扰等技术与方法，探讨NO在烧伤后ESC脱粘附离巢中的作用及机制，以验证我们的假说，从而进一步丰富烧伤创面修复机理，并为烧创伤创面治疗提供新思路。

表皮干细胞(ESC)通过整合素等粘附分子固定于皮肤特定巢穴中，其离巢迁移是启动烧创伤创面修复的关键步骤之一，但烧创伤后ESC是如何离开其固有巢穴并迁移的机制并不清楚。本课题主要讨NO在烧伤后表皮干细胞离巢迁移中的作用及机制研究。首先本课题组采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步消化法和Ⅳ型胶原快速粘法成功培养出人表皮干细胞，且完成人表皮干细胞的鉴定。以硝普钠(SNP)作为NO的供体，研究NO对HaCaT细胞迁移作用的影响，以及“NO-cGMP/PKG-β1整合素/Rho GTPase-细胞骨架-HaCaT细胞迁移”信号通路实验。以S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine，SNAP）作为NO（Nitric Oxide）供体，研究NO对的hESC迁移、脱粘附、增殖等生物学功作用影响；以及“NO-cGMP/PKG- Rho GTPase-细胞骨架-细胞迁移-创面愈合”信号通路研究。我们研究发现：1、动物实验中，采用传统BrdU滞留法标记ESC，在浅二度烫伤模型下成功建立表皮干细胞迁移模型，并证明NO具有促进烧伤创面的愈合、促进烧伤创面ESC迁移作用；2、NO对HaCaT细胞具有迁移作用，NO促进HaCat细胞迁移作用机制可能是通过活化GC，使cGMP -PKG增加，β1-整合素表达下降/RhoGTP酶活性增强，引起细胞骨架的改变，最终促进细胞迁移；3、NO对hESC的生物学作用机制可能是通过cGMP，使Rho GTPase中的Rac 1、Rho A表达增强，从而引起细胞骨架的改变，并产生多种生物学功能的改变，促进细胞迁移，最终促进创面愈合。本课题的完成进一步阐明烧伤创面修复机理，并为烧创伤创面治疗提供新的思路与策略。