波里马细胞质雄性不育温敏基因的克隆和功能研究

Polima cytoplasmic male sterility (pol CMS) plays an important role in the utilization of heterosis in rapeseed, the fertility are controlled by restore genes in nuclear and CMS genes in mitochondrial, also affected by the external environment. The breeders cultivated two-line male-sterile line in rapeseed, the hybrid rapeseed production in China developed from three-line hybrid to two-line hybrid. The two line sterile lines are male sterile under high temperature and convert to male fertile at low temperature. In the previous study, the near-isogenic lines (NILs) were developed through repeated backcrossing between TCMS line and stable CMS line. Map-based cloning strategy will be used to isolate the TCMS gene, the candidate genes will be validated in complementation test. Then, the functional characterization of the TCMS gene will be done, such as gene expression pattern analysis, subcellular localization of the TCMS gene, identification of differentially expressed genes between NILs lines, modification of transcripts of CMS-associated orf224/atp6 gene. Through this project, the insights into the molecular mechanism for fertility conversion in TCMS system will be discovered, which is helpful to develop two-line male sterile lines and hybrid breeding.

波里马细胞质雄性不育系(pol CMS)在油菜杂种优势利用中具有举足轻重的作用，其育性受核内恢复基因和线粒体中的不育基因共同控制，此外，还会受到外界环境的影响。据此育种家培育了波里马两系不育系，油菜杂交种的生产经历了从三系到两系的发展。两系不育系在高温下不育（西北地区夏播制种）、低温下可育（武汉冬播繁殖不育系）。本实验室前期通过多代回交构建了近等基因系，完成了温敏基因的初步定位。在此基础上，本项目将进一步精细定位温敏基因，并通过图位克隆的策略分离温敏基因。利用 Real-Time PCR 技术、mRNA 原位杂交技术、启动子-GUS 报告基因系统和亚细胞定位解析温敏基因的时空表达特征，分析近等基因系间差异表达的基因，以及不育基因与温敏基因间的互作方式来剖析温敏基因功能，系统的解析 pol CMS 温敏不育系育性转换的分子机制，并将推动波里两系在油菜生产中发挥更大作用。

温敏雄性不育是一种受基因型-环境相互作用影响的重要农艺性状。油菜波里马细胞质雄性不育系(pol CMS)在油菜杂种优势利用中具有举足轻重的作用，其育性受核内恢复基因和线粒体中的不育基因共同控制，此外，还会受到外界环境的影响。据此育种 家培育了波里马两系不育系，油菜杂交种的生产经历了从三系到两系的发展。目前，对控制生育恢复的潜在分子机制知之甚少。本项目对 pol CMS 温敏基因进行定位，借助DNA 芯片和BSA测序，将温敏基因定位于 scaffoldA07（1.092 Mb- 3.379 Mb, 7.048 Mb - 10.588 Mb）和 scaffoldA08（12.900 Mb -14.192 Mb）染色体上；并进一步研究pol TCMS系在两种不同环境温度（16◦C和25◦C）条件下的基因表达差异 。研究结果表明：在线粒体中发现了一种新的orf224-atp6共转录物，可能导致pol-TCMS系的育性转换。RNA-seq分析表明，与1318和596-H的不育花相比，596-L的可育花中1637个基因显著差异表达。差异表达基因与温度反应、ROS积累、花药发育和线粒体功能有关。单分子长读同种型测序与RNA测序相结合，揭示了许多基因在高温下产生选择性剪接转录物。我们还发现在低温条件下，替代氧化酶、II型 NAD(P)H 脱氢酶和转录因子Hsfs可能在花粉发育中发挥关键作用。RNA测序和大片段分析结合全基因组测序确定了参与orf224转录后修饰的候选基因。总的来说，本项目初步定位了温敏不育相关的候选基因，并解析了环境温度控制的pol TCMS系的育性恢复机制，这些研究结果为波里马“两系”杂种系统更加广泛的推广应用奠定了理论基础。