石竹温敏雄性不育相关基因的筛选克隆及功能分析

石竹是国内外重要的观赏花卉，广泛应用于城市园林绿化和花卉装饰中。在前期的研究中我们发现，石竹在低温条件下会出现温敏雄性不育现象。这种现象应用于育种工作，可减少人力，节省时间，节约成本。而分离温敏雄性不育性状控制基因，是有效利用其进行杂交育种的关键和基础。本研究以石竹温敏雄性不育系Dc-06和Dc-08为材料，利用cDNA-AFLP和SSH技术，构建相关不育基因表达谱；通过同源比对分析，了解所涉及基因的功能、种类、数量。利用RACE技术得到目标基因全长，进而利用RT-PCR、Northern和原位杂交等方法进行相关基因的表达分析；并构建干涉、正义和反义等载体，转化拟南芥、烟草和可育石竹，对其功能进行验证。本项目从分子调控方面揭示石竹温敏雄性不育系育性转换的机理，可为今后石竹新品种的培育奠定重要的工作基础，为进一步利用雄性不育系进行杂种优势育种提供理论依据。

石竹为石竹科石竹属多年生草本花卉，具有广泛的应用价值和经济价值。在长期的育种工作中，课题组人员发现了低温敏感型温敏雄性不育材料‘盈盈’。本研究以‘盈盈’为材料，对其进行低温处理和常温处理。对不同温度条件下花药发育过程进行观察研究，发现‘盈盈’花药发育过程分为造孢细胞、小孢子母细胞、四分体、单核花粉粒和成熟花粉粒5个时期。前三个时期不同温度处理下花药发育过程无明显差异，而在单核花粉期和成熟花粉期差异明显，低温处理下花药绒毡层异常膨大并推迟降解，后期药室皱缩，花粉粒稀少而且干瘪。通过对石竹的转录组进行测序分析，共获得8.35Gb有效转录数据，65535个 Unigene 序列。GO 功能注释表明归于分子功能的Unigene有13813个，生物过程相关的Unigene有33227个，细胞组分相关的Unigene共17397个。将65535个 Unigene 序列与KEGG 数据库比对，其中17250个 Unigene 具有 Pathway 注释，涉及的 Pathway 共131个，主要包括新陈代谢相关通路、遗传信息加工相关通路、细胞进程通路和环境信号处理等通路。进一步进行RNA-Seq分析得到2588条差异基因，其中有109条差异基因属于细胞结构差异基因。结合基因表达谱差异结果，筛选出与花药发育相关的22个基因进行深入分析，其中 BAM2、EXS、MPK6、RPK2、SAP、TDR 6个基因存在显著差异，与其半定量分析结果一致。进而对这6个差异基因进行进一步分析，选用pCAMBIA2300s（Kanr，CaMV 35S promoter，NOS terminator，T-DNA）超量表达载体，构建6个温敏雄性不育相关基因APRT、UGP、EXS、RPK2、SAP、TDR的超量表达载体，转化石竹进行表形分析。