EGF/PAMAM自组装纳米载体介导siRNA沉默MDR1基因逆转肿瘤多药耐药的研究

Tumor multidrug resistance (MDR) is a serious obstacle to cancer chemotherapy. Currently, drug resistance to chemotherapy is believed to cause failure in over 90% of patients with metastatic cancers. RNA interference (RNAi) represents a promising gene silencing technology for functional genomics and a potential therapeutic strategy for a variety of genetic diseases. However, in the absence of safe and effective carriers for in vivo delivery of small interfering RNAs (siRNAs), application of this technology for therapeutic purposes has lagged behind. The objective of this research is to develop a promising MDR 1-targeted siRNA nano delivery system for effectively reversing EGFR+ tumor MDR. Toward this goal, MDR 1 siRNA based on different target is firstly to be designed and synthesized, and their combined anti-MDR efficiency is also to be studied. Further, a novel self-assembled EGF-dendriplexes by binding negatively charged EGF to activated PAMAM dendrimer-siRNA complex will be designed and prepared. We expect to utilize this EGF/activated PAMAM/siRNA system to silence MDR 1 gene, thus reversing EGRF+ tumor MDR. Moreover, we also expect to study the possibility and mechanism of muti-target gene therapy for reversal of tumor MDR.

肿瘤多药耐药（MDR）问题是当前肿瘤治疗药物研究领域中的重大问题。利用RNA干扰等基因治疗方法逆转肿瘤MDR被认为是最有前景的手段，但如何解决RNA给药问题，以实现其体内靶向递送及功能高效表达是目前RNA药物发展中需迫切解决的关键技术及难点。本课题针对肿瘤MDR问题，拟设计一种细胞-基因递次靶向siRNA给药系统。首先以MDR1基因为靶点，设计合成针对MDR1基因不同位点的siRNA，在此基础上为实现siRNA的体内靶向递送，进一步以EGFR为靶点，采用表皮生长因子（EGF）修饰活化的树枝状高分子聚酰胺-胺（PAMAM），设计并构建新型的肿瘤靶向纳米载体，通过此靶向纳米载体介导siRNA沉默目的基因MDR1，达到细胞-基因递次靶向，从而有效逆转EGFR+肿瘤细胞MDR。在此基础上，尝试采用这种靶向纳米载体同时介导针对不同位点的siRNA，探索多靶点基因联合治疗肿瘤MDR的可能及机制。

利用RNA干扰逆转肿瘤MDR被认为是很有前景的手段，但如何实现RNA靶向递送及高效表达是其中要解决的关键问题。本课题研究以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点，在树枝状高分子PAMAM载体基础上采用不同配体（EGF/尼妥珠单抗h-R3）对其进行修饰，设计构建了针对EGFR的新型基因靶向递送系统，可以实现siRNA在EGFR+肿瘤细胞中的有效递送。在此基础上针对MDR1 siRNA进行研究，结果表明这类递送载体可有效介导siRNA沉默目的基因MDR1，达到细胞-基因递次靶向，从而有效逆转EGFR+肿瘤细胞MDR。主要研究结果包括：.1. EGF/h-R3修饰的PAMAM靶向纳米递送载体的设计与构建.基于PAMAM设计了针对EGFR的EGF/h-R3-PAMAM两种靶向基因递送载体，首先研究了其对质粒DNA的包载及递送效果，筛选出具有较强包载DNA能力和适宜纳米粒度与表面电荷的载体系统，它们在EGFR高表达的HepG2细胞中有较高的转染效率、细胞摄取率及肿瘤靶向效果。.2. EGF/h-R3修饰的PAMAM靶向纳米载体用于siRNA递送.设计制备了三种配体（HSA/EGF/h-R3）修饰的siRNA递送系统（HSA为前期研究配体），均具有较好的包载siRNA能力、均一的粒径与适宜的表面电荷，且具有一定的逃逸内涵体能力和肿瘤靶向递送效果，作用效果h-R3-dendriplex＞EGF-dendriplex＞HSA-dendriplex。h-R3-dendriplex能有效递送PLK1 siRNA，具有较好的基因沉默效果及抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭能力。 .3. EGF/h-R3修饰的PAMAM靶向纳米载体用于递送MDR siRNA从而克服肿瘤MDR.进一步将EGF/h-R3-PAMAM靶向载体用于递送MDR1 siRNA，以实现逆转肿瘤MDR的效果。EGF-PAMAM-MDR1 siRNA逆转子宫肉瘤癌多药耐药和h-R3-MDR1 siRNA-PAMAM逆转乳腺癌多药耐药的研究表明，两种载体系统均能有效递送MDR1 siRNA到肿瘤细胞，显著沉默MDR1基因，同时下调P-糖蛋白的表达。进一步与紫衫醇联合用药研究表明，两种MDR1 siRNA复合物与Taxol联用均可增强其对耐药细胞增殖抑制和促进细胞凋亡的作用，并且能够抑制肿瘤耐药细胞迁移。.