Dmrt1通过Rec8调控斜带石斑鱼精子发生的作用和机制研究

Dmrt1 is key gene for male sex differentiation and sex determination, it is mainly expressed in sertoli cells, but in grouper, the Dmrt1 expression in spermatogonium and spermatocyte. Rec8 is an essential gene in the process of spermatogenesis, and it is important to initiate meiosis. In previous studies , we found Dmrt1 can promote Rec8 expression in Orange-spotted grouper, and three Dmrt1 binding sites were found on the rec8 gene promoter, suggests that Dmrt1 in the germ cells of grouper may regulate rec8 gene. In this project, we using gene expression analysis, chromatin immunoprecipitation, electrophoretic mobility shift assay, promoter deletion mutation, dual-luciferase reporter gene assay, in vivo and in vitro experiments to determine the transcriptional regulation mechanism of Dmrt1 and Rec8. In addition, the effect of Dmrt1 and Rec8 on spermatogenesis was observed by single and simultaneously knock down these two genes. In terms of theory, we revealed the effect and mechanism of Dmrt1 regulation spermatogenesis in orange-spotted grouper by Rec8. On the application, this research may help to solve the problem of male grouper spermatogenetic failure in recent years.

Dmrt1是雄性性别分化和性别决定的关键基因，主要表达于脊椎动物精巢支持细胞中。然而，在石斑鱼中Dmrt1特异性的表达于精原细胞和精母细胞中。Rec8是精子发生过程必不可少的基因，对生物开启减数分裂至关重要。在前期的研究中，我们发现Dmrt1能够促进斜带石斑鱼Rec8的表达，并且在rec8基因启动子上存在三个Dmrt1结合位点，提示生殖细胞中的Dmrt1可能对rec8有直接的调控作用。为此，本项目拟通过基因表达分析、染色质免疫共沉淀、凝胶阻滞实验、启动子缺失突变、双荧光素酶报告系统和在体离体实验探究Dmrt1对Rec8的调控机制。此外，通过单独和同时降低Dmrt1、Rec8表达分析二者对斜带石斑鱼精子发生的作用机制。理论上，有助于解析Dmrt1通过Rec8调控石斑鱼精子发生的作用和机制；应用上，为解决近年来在育种过程中出现的雄性石斑鱼产精难的问题提供思路。

石斑鱼为典型的雌雄同体雌性先熟鱼类，在人工繁育中往往存在雄鱼缺乏或成熟度不够的现象。Dmrt1是雄性性别分化和性别决定的关键基因，而Rec8是精子发生过程必不可少的基因，对生物开启减数分裂至关重要，提示Dmrt1和rec8基因可能对石斑鱼精子成熟有重要作用。在此基础上，我们深入探讨Dmrt1和Rec8在斜带石斑鱼精子发生过程中的作用。本研究首先对石斑鱼的性反转过程进行探索，了解石斑鱼由雌转雄的过程中激素水平的变化、雌雄性别相关基因的变化以及雌雄生殖细胞的转化过程。进一步，克隆得到斜带石斑鱼Rec8基因的全长序列信息，Rec8基因全长2244bp，其中198bp的5’UTR和284bp的3’UTR，开放读码框为1752bp，编码584个氨基酸。同时，对其组织表达模式进行，分析发现Rec8在斜带石斑鱼精巢中表达量比较高，此外检测性腺不同发育时期Rec8的表达量，发现Rec8在精巢时期表达量最高，在兼性性腺表达量也比较高，表明该基因对精巢发育有关键作用。进一步，制备了Rec8的多克隆抗体，免疫组化结果表明Rec8主要分布在进行减数分裂的生殖细胞中，表明其对生殖细胞减数分裂至关重要。为进一步研究Rec8和Dmrt1的调控关系，通过克隆获得Rec8的启动子区域，并且在该启动子上发现了3个Dmrt1的结合位点，通过染色质免疫共沉淀（ChIP）明确了Dmrt1与Rec8存在调控作用，进一步对三个结合位点进行点突变发现第二个结合位为Dmrt1调控Rec8基因的关键结合位点。为了深入探究Dmrt1和Rec8在活体状态下是否对精巢发育和成熟有作用，我们构建了Dmrt1和Rec8的真核表达载体，并应用脂质体包被真核表达载体，通过活体手术将包被好的载体直接注射到赤点石斑鱼未发育成熟的精巢中，发现单独注射dmrt1或rec8质粒，以及同时注射dmrt1质粒和rec8质粒都能够显著诱导石斑鱼精巢成熟，并且精子密度和精子活力与自然成熟的精巢产生的精子相当。这表明，Dmrt1和Rec8在活体注射的情况下可以显著促进石斑鱼精巢的成熟。以上的研究成果丰富了我们对鱼类精巢发育调控机制的认识，同时也为诱导石斑鱼精子成熟提供了新思路。