受猪戊型肝炎病毒pORF3影响的关键的内源性miRNAs的鉴定及其调控靶基因的分子机制

The study of Swine Hepatitis E（SHE）is very important for public health. In order to elucidate the pathogenic mechanism of Swine Hepatitis E virus (SHEV) more clearly, based on the obtained data about SHEVpORF3 study in our lab, miRNA array technique were performed to analyze the effects of pORF3 on miRNAs expressing profiling of swine primary cultured hepatocytes; qRT-PCR were used to confirm the results; PicTar and TargetScan softwares are used to predict the target genes of miRNAs which are upregulated and downregulated; 3'UTR report gene experiments are used to confirm the binding sites of miRNAs; mimics miRNAs overexpression assay and the miRNAs inhibitors assay are used to analyze the function of miRNAs.These ex vivo data will be helpful for elucidating pORF3-miRNAs-target gene regulation mechanism and further provide the important basis for the prophylaxis of SHEV infection.

猪戊型肝炎(SHE)是一种重要的人兽共患传染病. 我们在前期实验中发现, 与HEK293细胞和稳定表达pEGFP的HEK293细胞相比，在稳定表达pEGFP-ORF3的HEK293细胞，miR-221/222显著下调，并且直接调控p27kip1. 为了阐释pORF3 在ex vivo条件下的功能，本课题拟通过慢病毒介导, 获得稳定表达pEGFP-ORF3的猪的肝原代细胞; 应用miRNA 芯片技术分析稳定表达pEGFP-ORF3的猪的肝原代细胞的miRNAs 表达谱, 筛选获得差异表达的内源性miRNAs; 应用定量PCR进行验证; 应用PicTar等软件预测其靶基因; 应用3'UTR报告基因实验验证其结合靶点；应用mimics过表达或inhibitor抑制miRNAs表达实验验证其功能. 从而全面阐释pORF3-内源性miRNAs-靶基因的调控机制，为SHE的预防提供重要依据.

基于前期获得的miRNAs差异表达的研究结果，我们主要开展了以下三个方面的工作。..1. 运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP－ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱，筛选出表达水平上调／下调的基质金属蛋白酶。结果表明，在稳定表达pEGFP－ORF3的L02细胞中，TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低。本试验结果为ｐORF3对L02细胞中基质金属蛋白酶相关蛋白表达影响的分子机制研究提供了理论依据。..2. 应用人磷酸化MAPK抗体微阵列比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的磷酸化MAPK表达谱，筛选获得显著上调／下调的磷酸化MAPK。结果发现，在稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞，p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK2、p-RSK1的表达水平升高，而p-P38б表达水平降低。结果表明，ORF3 蛋白影响了HEK293 细胞的p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK2、p-RSK1、p-P38б等MAPKs的磷酸化水平，为HEV ORF3对于靶细胞磷酸化MAPK表达影响的分子机制研究提供了重要依据。..3. 成功构建了HepG2-pEGFP-ORF3稳定细胞系，应用高通量测序技术对HepG2-pEGFP-ORF3细胞系进行转录组测序, 并分析差异基因（DEGs）表达情况, 应用荧光定量实时PCR对差异基因进行进一步验证，最后, 通过GO对差异基因进行分类。结果表明，在ORF3稳定表达细胞系HepG2-pEGFP-ORF3中, CLDN6、YLPM1、APOC3、NLRP1、SCARA3、FGA、FGG、FGB、FREM1和LINC00958基因在mRNA水平表达上调； 而SLC2A3、DKK1、BPIFB2和PTGR1基因在mRNA水平下调。说明ORF3作为戊型肝炎病毒的重要调节蛋白，通过影响膜蛋白和和基底膜蛋白的表达，在病毒与靶蛋白的相互整合过程中发挥着重要作用。