ERF4调控苹果果实质地发育的分子遗传机制研究

Fruit texture is a fundamental aspect of fruit quality. A highly significant QTL cluster for apple fruit textural components was mapped on chromosome 3 and co-located with ERF4. Sequence analysis showed that 2 SNPs in the EAR region of ERF4. Combined with the genetic analysis, suggest that the ERF4 mutant allele confers fruit texture. In this project, we will target on the molecular genetic mechanism of apple fruit texture to explore the contribution of ERF4 allelic variation to fruit texture. With the identification of gene marker closely linking to fruit texture was used in the early selection assisted of apple. The technology will greatly shorten the breeding cycle and accelerate the breeding process for breeders to select new varieties with significant character.

果实质地是构成果实品质的重要指标，本实验室前期从果实质地QTL区段中筛选得到乙烯响应转录因子ERF4，发现其EAR结构域的SNP突变与果实质地性状紧密相关。在此基础上，本研究以ERF4基因SNP位点作为突破口，通过分析该位点对基因的转录抑制活性影响及对下游细胞壁降解基因的转录调控验证等试验，深入揭示苹果果实成熟质地变化的分子遗传调控机制，探讨ERF4关键结构域SNP位点是否通过影响其转录抑制活性来调控对苹果质地变化，以期发现新的苹果果实质地性状标记基因，并将为苹果品种改良分子育种、培育优良并具有自主知识产权的苹果新品种供基因储备和理论指导。

本课题组前期通过对苹果杂交群体QTL定位，在苹果3号染色体上鉴定得到了一个与果实成熟相关的乙烯信号响应因子ERF4，它在EAR（ethylene response factor-associated amphiphilic repression）结构域上存在一个C-G突变。为了明确ERF4在苹果果实成熟过程中的调控机制，本研究通过GWAS全基因组关联分析，并结合转录组测序（RNA-seq）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）技术，解析ERF4蛋白复合体参与苹果果实成熟的遗传机制。结果如下：.（1）ERF4转录调控分析：ChIP-seq表明ERF4与ERF3的启动子结合，ERF3参与乙烯生物合成的调控。ERF4的EAR结构域突变导致ERF3表达受抑制程度降低，进而促进乙烯的产生和果实硬度的降低。ERF4是一种转录抑制因子，其活性受与EAR基序结合的辅抑制因子4（TPL4）的调控，生物膜干涉试验（BLI）分析表明，EAR基序的突变导致ERF4与TPL4的相互作用能力降低。同时，在瞬时沉默的苹果果实中，抑制ERF4或TPL4均促进了果实成熟和乙烯释放。.（2）ERF4组蛋白去乙酰化调控分析：组蛋白去乙酰化酶（HDA19）被招募到ERF4-TPL复合物中，从而促进果实乙烯的生物合成。抑制HDA19的表达，促进果实成熟和乙烯的产生。为了寻找受HDA19调控的潜在下游靶基因，我们对H3K9进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和定量PCR（ChIP-qPCR）分析，发现HDA19去乙酰化乙烯生物合成基因ACS3a编码的蛋白的H3K9残基，并与ERF4-TPL4形成复合物，通过降低乙酰化程度直接抑制ACS3a的表达。我们证明，ACS3a中的一个早熟特异乙酰化H3K9ac峰和ACS3a的表达在早熟品种果实中特异性上调，而在晚熟品种中没有上调。因此，在早熟苹果品种中，ERF4 EAR的C-G突变降低了ERF4-TPL4-HDA19的去乙酰化活性，从而降低了对下游的转录抑制，并增加了ACS3a的表达。.综上所述，ERF4蛋白复合体参与苹果果实成熟过程，有两条途径协同作用，一是ERF4作为转录因子，结合TPL4调控下游ERF3的转录水平，从而参与果实成熟过程；二是ERF4-TPL4复合体招募去乙酰化酶HDA19，通过去乙酰化作用参与果实成熟过程。