基于肌浆/内质网Ca2+-ATP酶SUMO1修饰研究参附益心颗粒治疗大鼠心梗后心衰的作用及其机制

Heart failure is characterized by contraction function damage and Ca2+ homeostasis imbalance at cellular level. Sarcoplasm/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase(SERCA2a) is an important calmodulin that maintaining intracellular Ca2+ homeostasis. Impaired SR Ca2+ uptake resulting from decreased expression and reduced activity of SERCA2a can strengthen the endoplasmic reticulum stress (ER stress) reaction and caused cellular damage. SUMO modifcation（SUMOylation）is a versatile post-translational protein modification which can regulate SERCA2a function. The improvement of the expression of SUMO1 and SERCA2a SUMO1 modification can effectively improves cardiac function in heart failure rats. Primary research suggested that Shenfu Yixin granule can improve heart function and reduce the myocardial cell apoptosis, but the specific mechanism is unclear. We hypothesis that Shenfuyixin granule maybe increase the expression of SERCA2a and SUMO1 modification to reduce the endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis.We will determine the effects of Shenfu Yixin granule on the expression of SERCA2a and SUMO1 modification in rats of chronic heart failure surrounding ER stress-apoptosis signaling pathway. Moreover, we will clarify the mechanisms of Shenfu Yixin granule on hypoxia-induced cardiomyocyte apoptosis by siRNA transfection technique in an in vitro cardiomyocyte culture model and provide experimental basis for therapeutic approach to alleviate heart failure.

心力衰竭在细胞水平的特征是收缩功能损害和Ca2+稳态的失衡。肌浆/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)是维持细胞内Ca2+稳态的重要钙调蛋白，SERCA2a表达及活性下降引起Ca2+再摄取障碍，进而引起内质网应激（ER stress）相关的细胞凋亡。SUMO1化修饰是一种关键的调节SERCA2a功能的翻译后修饰过程，提高心肌细胞SUMO1的表达及SERCA2a的SUMO1修饰水平能有效改善心衰大鼠心功能。前期研究提示参附益心颗粒能够改善心功能，降低心肌细胞凋亡，但具体机制尚不明确。我们认为参附益心颗粒有可能通过提高细胞SERCA2a表达以及SUMO1修饰来降低内质网应激相关的细胞凋亡，进而治疗心力衰竭。本课题围绕SERCA2a及SUMO1修饰在整体动物实验基础上，用SiRNA干扰技术探讨参附益心颗粒对缺氧诱导的离体心肌细胞凋亡的影响，阐明参附益心颗粒治疗大鼠心梗后心衰的作用机制。

本项目基于Ca2+稳态失衡在心力衰竭进展中的重要作用和参附益心颗粒的前期研究基础，在大鼠心梗后心衰动物模型和离体细胞模型上，探讨参附益心颗粒对心衰大鼠的保护作用，验证参附益心颗粒治疗心衰的作用机制是否与“改善钙离子稳态调节蛋白表达，影响肌浆/内质网Ca2+-ATP酶活性及其小泛素化程度，调节内质网应激凋亡通路蛋白表达，进而抑制心肌细胞凋亡”有关的假说。首先，在心梗后心衰动物模型上初步明确参附益心颗粒的保护作用及其作用机制：参附益心颗粒干预后，受损的心肌组织钙离子稳态调节蛋白RyR2表达升高，PLN、CAMKⅡ表达下降；肌浆/内质网Ca2+-ATP酶SERCA2a蛋白、SUMO化蛋白SUMO1表达升高；SUMO活化酶E1、结合酶E2表达升高；内质网应激凋亡相关蛋白CHOP、caspase-9、caspase-12、Bax表达下降、Bcl-2表达升高；细胞凋亡率下降。其次，从离体细胞角度探讨参附益心颗粒保护心肌细胞的作用机制：体外培养H9C2心肌细胞，利用SiRNA干扰技术抑制SERCA2a基因表达，分别阐述参附益心颗粒含药血清对缺氧、SiRNA干扰、缺氧联合SiRNA干扰引起的心肌细胞损伤的保护作用及其可能的机制。参附益心颗粒对缺氧、SiRNA干扰、缺氧联合SiRNA干扰损伤均有影响的指标有：均明显促进SERCA2a、SUMO1蛋白、SUMO化相关酶表达；均能降低各损伤因素引起心肌细胞凋亡率；均明显抑制CAMKⅡ、p-JNK表达；同时，参附益心颗粒对缺氧、SiRNA干扰、缺氧联合SiRNA干扰分别引起的细胞损伤也有不同程度的调节作用。总之，本项目研究丰富了参附益心颗粒治疗心衰作用机制的作用靶点和基础数据，提示参附益心颗粒可能通过改善钙离子稳态调节蛋白表达，调节内质网应激凋亡通路和小泛素化蛋白表达、抑制心肌细胞凋亡而改善心衰。