糖蛋白分子印迹聚合物的制备及其在免疫分析中的应用

Antibodies are molecular workhorses of life science and clinical diagnostics but are difficult to produce, expensive and instable. Antibodies against glycoproteins are of great importance in biomedicine and clinical diagnostics. Molecular imprinting is an important technology to produce biomimetic materials with antibody-like specificity. Molecular imprinting of biological macromolecules is one of the challenging research frontiers. Up to date, a general approach for molecular imprinting of a sub-class of proteins has not been established yet. This project aims at developing a general approach for molecular imprinting of glycoproteins by virtue of boronate affinity molecular recognition and photo-initiated copolymerization, to produce molecularly imprinted polymers (MIPs) with specific selectivity, high capacity and fast mass transfer. The soft-lithographic technology that has been widely used in micro- and nano- fabrication areas will be introduced into the developed approach to prepare patterned MIP arrays. MIP arrays-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methods will be established for glycoprotein biomarkers-based early screening of cancer diseases. On the basis of these approaches, molecularly imprinted monolithic columns of glycoproteins will be developed and their combination with biological mass spectrometry will also be developed. The applicant and his team have paved sound background knowledge and techniques for this project. Some preliminary investigations have been implemented, which indicated that the proposed approaches in this project are feasible. The project can facilitate not only the development of molecular imprinting methodologies but also the applications of molecular imprinting technology in real world such as clinical diagnostics.

抗体是生命科学和疾病诊断等领域不可缺少的核心分子工具。但是，抗体存在制备困难、价格昂贵和稳定性差等缺点。糖蛋白的抗体在生物医学和临床应用等领域具有重要意义。分子印迹是制备具有类似抗体专一性的仿生材料的重要技术。生物大分子的分子印迹是具有挑战性的研究前沿之一。目前还没有能印迹任何一个蛋白亚类的普适性方法。本项目提出利用硼亲和识别作用与光引发聚合反应，建立制备选择性专一、容量高、传质快的糖蛋白的分子印迹聚合物的普适性方法；引入软光刻技术，制备图案化的分子印迹聚合物阵列，并建立基于分子印迹聚合物阵列的酶联免疫分析方法，用于癌症等疾病的早期筛查；在此基础上，探索糖蛋白的分子印迹整体柱的制备，并建立与生物质谱联用的方法。申请人研究组有良好的工作基础，并做了必要的预研，本项目的研究方案可行性高。本项目不仅能促进分子印迹技术的方法学发展，而且能促进分子印迹技术在临床诊断等方面的实际应用。

抗体是在生命科学研究、临床诊断和疾病治疗中的核心分子识别试剂。但是，抗体存在着高专一性不易获得、价格高昂、重现性较差和稳定性较差等缺点。因此，能克服这些缺点的抗体替代物具有重要的科学意义和应用价值。分子印迹是制备具有类似抗体分子识别特性的人工材料的重要技术，已经在分离、传感与分析等领域取得广泛应用。蛋白质的印迹是一个重要挑战，因为蛋白质在通常的印迹条件下易变性且印迹后不易除去。糖蛋白是一类具有重要生物学意义和临床诊断价值的蛋白质，此前未有针对糖蛋白结构共性的分子印迹方法的报道。在项目组多年硼亲和材料研究积累的基础上，本项目旨在发展对目标糖蛋白具有优异识别性能的分子印迹聚合物（MIP），进而发展出先进的免疫分析新方法。首先建立了便捷和通用的光刻硼亲和分子印迹法，所得硼亲和MIP展现了优异的分子识别性能。该工作开辟了硼亲和分子印迹新方向。以所制备的分子印迹阵列为基底，发展出新颖的免抗体、免酶的免疫分析法—硼亲和夹心法，该方法专一性好、灵敏度高、分析速度快，成功应用于人血清样品中肝癌标志物甲胎蛋白的测定，开辟了快速疾病诊断分析新路径。建立了适用于从糖蛋白、聚糖到单糖的便捷和通用的硼亲和可控定向表面印迹法，可以根据模板分子的尺寸大小选择分子印迹时间，所得MIP性能优良，突破了糖和聚糖的抗体难以制备的限制，成功应用于不稳定糖蛋白的识别和癌细胞的靶向识别与成像分析。建立了可在介孔内对小分子化合物进行印迹的双模板对接定向分子印迹法，方法便捷、高效，所得介孔材料选择性好、容量高、吸附-解吸可控，成功应用于蛋白质磷酸化修饰分析。此外，我们还考察了硼亲和分子间相互作用构-效规律、多位点协同和纳米限域效应等相关基础问题和固相标记等相关应用。发表SCI论文27篇，影响因子大于3的论文25篇，影响因子大于5的论文18篇（含Nat. Protocols 1篇、Chem. Sci. 3篇、Anal. Chem. 7篇），影响因子大于10的论文5篇（含Angew. Chem. Int. Ed. 4篇和Chem. Soc. Rev. 1篇）。1篇Angew. Chem. Int. Ed.论文被选为VIP论文，1篇Anal. Chem.论文被选为ACS Editors’ Choice。申请发明专利6项，获专利授权3项。项目负责人因这些贡献被选为国际分子印迹学会理事。