面向糖蛋白组学分析的整体毛细管柱硼亲和色谱-质谱联用方法的发展

糖蛋白的富集和分离是糖蛋白质组分析中的关键科学问题，目前的主要方法，如凝集素亲和色谱法、肼化学法和亲水作用色谱法，存在通量低或选择性差等缺点。本项目提出基于整体毛细管柱硼亲和色谱的两种联用方法：１）硼亲和富集－基体辅助激光解吸电离质谱离线联用，２）纳流二维液相色谱－电喷雾质谱在线联用。硼亲和整体柱采用协同共单体开环聚合法制备，具有选择性专一、亲和能力高和容量高等优点。离线联用模式下，样品中的糖蛋白或糖肽经硼亲和整体毛细管柱富集、洗脱后直接点靶，然后进行质谱分析。该方法适用于组成简单的样品。在线联用模式下，样品酶解后的糖肽先经第一维的硼亲和整体毛细管柱富集，然后经第二维的反相或亲水相互作用色谱进行分离，用电喷雾质谱进行检测。该方法适用于组成复杂的样品。由于硼亲和的广谱性和整体柱的快速分离能力，联用方法通量高。同时，由于非糖肽被除去，方法灵敏度高。本项目能对糖蛋白组学分析起重要的促进作用。

本项目围绕硼亲和整体柱和相关功能化材料的制备以及相应的硼亲和色谱-质谱联用方法的建立展开研究。合成了3种结构新颖、亲和力强的取代硼酸配基，并利用自行建立的亲和毛细管电泳法从市售试剂中筛选出3类高亲和力取代硼酸。提出了团队硼亲和分子自组装法、光刻硼亲和分子印迹法以及硼亲和定向表面印迹法等新颖的材料制备方法，以及利用协同效应增强亲和力的策略。制备了8种硼亲和整体柱，2种硼亲和磁性纳米材料，3种硼亲和分子印迹聚合物材料和1种硼亲和基质辅助激光解吸离子化质谱靶板。本项目启动前，硼亲和色谱中的最低结合pH为7.0，而到项目执行期期满时，已将最低结合pH降低为4.5，使得硼亲和材料的适用范围涵盖了常用生理样品，大大扩展了应用范围。制备了具有类似蛋白A高专一性的硼亲和仿生整体材料，首次从材料水平上实现对生物分子性能的仿生，在生物制药领域中的抗体纯化具有重要应用前景。提出阐明了硼亲和分子印迹法中的分子作用机理，极大地丰富了对硼亲和材料的认识，为硼亲和材料的发展提供了新的方向。在此基础上，发展出在线和离线各1种硼亲和色谱-质谱联用方法。基于以上硼亲和色谱-质谱联用方法，从唾液中鉴定了多个低丰度糖蛋白，并从糖蛋白的胰蛋白酶酶解产物中鉴定到22个糖肽，所能鉴定到的糖肽数超过了目前文献中的最高水平。还实现了唾液酸化糖蛋白和非唾液酸化糖蛋白的选择性富集与检测。此外，将本项目所发展出的硼亲和整体柱及分子印迹材料的应用扩展至核酸适配体的筛选和基于糖蛋白疾病标志物的酶联免疫分析方法的建立。本项目已发表论文17篇（其中IF>5.0的论文12篇），申请发明专利6项（其中1项已获授权）。另有2篇论文已投稿和2篇论文在整理中。