酿酒酵母响应乙醇胁迫的动态分子机制研究

During the fermentation process, Saccharomyces cerevisiae cells are often inhibited by the accumulated ethanol, which has been considered to be the major hindrance to the complete fermentation and higher yield of ethanol. To maintain the cell survival, S. cerevisiae has evolved a set of stress responses to ethanol, while the mechanism underlying the ethanol tolerance is not fully understood. Based on our preliminary data presented in this application, we developed the following working hypothesis: At the two important stages of ethanol fermentation, e.g. the exponential and stationary growth phases of S. cerevisiae, the composition and concentration of some key proteins and metabolites of cells are regulated to response to the accumulating ethanol in the broth. In the current proposal, a systematic analytical approach has been employed to investigate the dynamic changes in the S. cerevisiae that are elicited by treatment with various concentrations of ethanol. In order to determine the modulation of the whole S. cerevisiae system, the metabolic and protein profiles will be determined using a global and unbiased perspective, which is expected to elucidate the molecular mechanism of dynamic responses to ethanol stress during the fermentation process. The aims proposed in this application are designed to test our hypothesis which has the potential to provide insightful information on the metabolic mechanism of ethanol production by S. cerevisiae. Furthermore, we also seek to elucidate the differential of metabolites and proteins induced by ethanol stress, and it will shed light on the identification of specific targets in the subsequent modification and manipulation of the S. cerevisiae fermentative strain to improve the conversion of raw material and yield of ethanol.

在酿酒过程中，酿酒酵母经常受到高浓度乙醇的胁迫，导致乙醇转化率和产量降低。在受到乙醇胁迫时，酿酒酵母细胞具有一套应激机制应对胁迫，但人们目前还缺乏对这种应激机制的系统了解。本项目将根据乙醇发酵过程中不同生长时期乙醇含量，设计乙醇浓度梯度，用以浸泡相应生长时期的酿酒酵母细胞。采用差异蛋白质组学技术和代谢组学技术，研究在发酵过程中两个重要阶段（指数生长期、稳定期），乙醇胁迫下酿酒酵母细胞蛋白质表达和代谢物组成、含量的动态变化情况，以期系统阐释酿酒酵母对乙醇胁迫的应激反应在发酵过程中随时间延长的变迁机制。这一应激机制的阐明将有助于人们更深刻的了解酿酒酵母发酵生产乙醇的代谢机理。同时，基于乙醇胁迫诱导的差异蛋白质以及差异代谢物，可使人们有针对性地寻找特定靶点进行改造，为构建更高产的乙醇发酵酿酒酵母菌株提供理论指导，进而有助于提高乙醇发酵转化率及产量。

在酿酒过程中，酿酒酵母经常受到高浓度乙醇的胁迫，导致乙醇转化率和产量降低。在受到乙醇胁迫时，酿酒酵母细胞具有一套应激机制应对胁迫，但人们目前还缺乏对这种应激机制的系统了解。本项目采用基于气相色谱-质谱联用的代谢组学技术，研究了酿酒酵母细胞代谢物组成、含量在不同发酵阶段（迟缓期、指数生长期以及稳定期）的动态变化情况，系统阐释了酿酒酵母对乙醇胁迫的应激反应在发酵过程中随时间延长的变迁机制。这一应激机制的阐明将有助于人们更深刻的了解酿酒酵母发酵生产乙醇的代谢机理。同时，本项目利用透射电子显微镜探究了酿酒酵母细胞膜结构在乙醇胁迫下的变化，结果表明细胞膜是乙醇首要攻击靶标，线粒体结构的裂解促进了细胞内活性氧自由基的累积，加重了细胞损伤。利用人工定向进化技术，本项目获得了耐受乙醇的酿酒酵母突变株，借助荧光定量PCR技术，本项目比较了原始菌株与两株分别耐受5%和10%v/v乙醇的突变株在膜组分含量及其关键表达基因表达量上的差异，结果表明突变株通过重构细胞膜获得了更高的乙醇耐受性。在此基础上，本项目进一步利用荧光定量PCR技术研究了细胞膜组分及其关键表达基因在酿酒酵母发酵过程中的变化，结果表明在乙醇发酵过程中，酿酒酵母细胞可通过重构细胞膜使细胞更易变形，从而获得更高的乙醇耐受性。此外，针对生物乙醇发酵中的杂菌污染问题，本项目也进行了研究。采用基于气相色谱-质谱联用的代谢组学技术，本项目研究了污染杂菌植物乳杆菌对酿酒酵母细胞代谢的影响，结果表明，植物乳杆菌除可通过分泌乳酸以及与酿酒酵母细胞竞争营养物和生存空间外，还可调控酿酒酵母细胞糖代谢，从而抑制酿酒酵母细胞生长。基于荧光定量PCR技术的结果表明，植物乳杆菌污染可影响参与酿酒酵母细胞中碳水化合物相关代谢的多数关键基因的表达；植物乳杆菌可抑制酿酒酵母细胞中糖酵解途径，但可促进三羧酸循环、乙醛酸循环、磷酸戊糖途径以及甘油合成，使得酿酒酵母细胞中碳物质从发酵过程被更多分配至呼吸过程。为消除污染的植物乳杆菌对酿酒酵母发酵的影响，本项目利用壳聚糖包裹植物乳杆菌噬菌体并添加至乙醇发酵体系中，有效抑制了植物乳杆菌的污染。上述结果可使人们更深刻理解酿酒酵母响应及耐受乙醇胁迫的机制，并有助于人们更深刻理解乙醇发酵过程中的菌群关系，从而为构建更高产的乙醇发酵酿酒酵母菌株提供理论指导，进而有助于提高乙醇发酵转化率及产量。