转基因体细胞克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究

Currently, there are many scholars believe that the incomplete reprogramming the reason of low efficiency of cloning in the process of somatic cell cloning. In this study, our laboratory obtained a number of transgenic somatic cell cloning sheeps for the material. We proposed by contrast the DNA methylation status of 8 imprinted related genes（Peg10、Peg3、Dlk1、Gtl2、Cdkn1c、H19、Igf2r和Xist） in death and survival of transgenic sheeps, which derived from male and female cell lines, and normal bovine organizations (Heart, lung, liver, kidney and muscle tissue). Each group selectted three individuals to explore whether there is abnormal DNA methylation of imprinted related genes in death and survival of transgenic individuals, to suggest that the death of individuals whether related to incomplete imprinted epigenetic reprogramming, and then look for the death cause of dead sheeps. The results by contrast with the DNA methylation status of imprinted related genes in somatic cell clone sheeps, to speculate whether the exogenous gene affect imprinted genes DNA methylation status and reprogramming.

目前，有许多学者认为不完全表观重编程是体细胞克隆过程中克隆效率低下的原因。本研究以本实验室获得的一批转基因体细胞克隆绵羊为材料，拟通过对比雌雄2种细胞系来源的出生死亡和存活的转基因绵羊与正常同龄自然交配生产绵羊的各个组织（心脏、肺脏、肝脏、肾脏和肌肉组织）中8个印记相关基因（Peg10、Peg3、Dlk1、Gtl2、Cdkn1c、H19、Igf2r和Xist）的DNA甲基化状态，各选择3个个体进行研究，探究死亡和存活的转基因个体是否存在印记相关基因异常DNA甲基化修饰，推测死亡个体是否存在印记表观重编程不完全，进而寻找死亡绵羊死因；同时通过与本实验室已研究过的这8个印记基因在体细胞克隆绵羊个体中的DNA甲基化状态进行对比分析，推测外源基因的导入是否对8个印记相关基因DNA甲基化状态有影响，进而推测外源基因的导入对印记基因重编程的影响。通过本项研究进而为体细胞克隆及转基因体细胞克隆技术的应用

目前，很多研究表明转基因克隆动物中DNA甲基化表现为多相的。但是，很少有研究证明转基因体细胞克隆绵羊中的DNA甲基化水平，可能主要是由于缺少转基因体细胞克隆绵羊的材料，或者绵羊基因组中的印记基因的信息。为了研究转基因体细胞克隆绵羊重编程的程度，本研究通过MassArray平台和重亚硫酸盐测序（BSP）法，检测了h19、igf2、igf2r、dlk1、gtl2、peg10、peg3和xist 8个印记基因在转基因克隆母羊、公羊和正常对照公羊、母羊的5种组织（心脏、肺脏、肝脏、肾脏和肌肉）中的甲基化状态。旨在调查转基因克隆绵羊的印记相关基因的重编程程度，为体细胞克隆以及转基因体细胞克隆技术的应用提供理论数据。研究结果显示：印记基因igf2和gtl2所有检测区在所测所有组（TSF与CSF、TSM与CSM、TSM与TSF）的组织之间甲基化水平无差异。印记基因h19基因R1在TSF和CSF之间肌肉组织中表现甲基化水平极显著差异， 除此之外，h19基因R1、R2和R3在TSF和CSF剩余组织、TSM和CSM、TSM和TSF各组织间甲基化水平都无差异。印记基因igf2r候选区R1甲基化水平在TSF与CSF肝脏中有显著差异，在TSF与CSF剩余组织、TSM和CSM、TSM和TSF组织之间中无差异。印记基因dlk1 R1区域甲基化水平在TSF和CSF、TSM和CSM、TSM和TSF各组织之间甲基化水平都无差异。R2区域在TSF和CSF的肺脏、心脏中表现极显著差异，在肌肉中显著差异，而在TSM和CSM、TSM和TSF组织之间甲基化水平无差异。dlk1基因R2区为可变剪切区域，此区域的46个CpG位点明显表现为组织甲基化特异性，TSF和TSM与正常对照组比较，在心脏中甲基化水平明显降低，在肺脏和肌肉中甲基化水平明显升高。而且，在肺脏部分位点表现高甲基化水平，如CpG_24和CpG_27，在肌肉中则表现为超甲基化水平，分别为0.99和0.97，几乎完全甲基化。这些结果显示，据此初步推测DNA甲基化水平可能影响印记基因的可变剪切事件。总之，我们获得了一定的数据表明在转基因体细胞克隆绵羊和对照组中存在个别印记基因的DNA甲基化差异。但是不足以作为充分的证据去证明转基因克隆绵羊在重编程过程中出现了异常，还需要更多的证据。