磷酸化修饰对PRRSV N蛋白功能的影响

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most important disease of pigs that threaten the swine industry around the world. PRRS virus(PRRSV) possessed a nucleocapsid (N) protein that is phosphorylated, and it was identified that the N protein contains several phosphorylation sites and mutating the Ser120 of N protein could result in the decrease of virus titer. Besides the Ser120, the phosphorylated Ser105 was also illustrated based on the previous work of our laboratory, we found that the mutation of Ser105 was responsible for the decrease of virus titer. Thus, it suggested phosphorylation of N protein could impact the replication of PRRSV via affecting the function of N protein. In the present study, reverse genetics system, mass-spectrometric technique（MS） and Surface Plasmon Resonance (SPR) were applied to investigate the phosphorylation of N. This study aims to identify the phosphorylation site of N and further verify the function of the protein that could be regulated by the phosphorylation of N, and reveal the relationship between phosphorylation of N and PRRSV replication mechanism. The present study contributes to the knowledge of the function of N protein, and it is theoretically meaningful to illustrate the details about the lifecycle of PRRSV and benefits the study of other Artertivirus.

猪繁殖与呼吸综合征是危害我国乃至世界养猪行业最重要的传染病之一。目前已证明猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白是一个含有多个磷酸化位点的磷酸化蛋白，其120位氨基酸被证明存在有磷酸化修饰，突变该位点会导致病毒滴度下降。我们前期研究中发现N蛋白除120位氨基酸外，第105位点也存在磷酸化修饰，突变该位点，同样会导致病毒的滴度下降。这些结果提示磷酸化通过影响N蛋白的功能，进而影响了病毒的复制能力。本研究拟以N蛋白磷酸化修饰为切入点，通过反向遗传操作平台、质谱技术和等离子表面共振等技术，鉴定并验证N蛋白的磷酸化位点，找出受到其磷酸化修饰调控的蛋白功能，阐明N蛋白磷酸化修饰对病毒生命活动的影响。该研究有利于加深对N蛋白功能的了解，对于阐明猪繁殖与呼吸综合征病毒生命活动过程也具有重要的理论意义，同时为研究其他动脉炎病毒的复制机制提供新的思路。

PRRSV N蛋白作为病毒中含量最丰富的蛋白，可以与PRRSV的Nsp9蛋白、Nsp10蛋白和病毒RNA发生相互作用。然而作为一个磷酸化蛋白，其磷酸化修饰对于蛋白的功能的影响尚未明确，并且N蛋白磷酸化位点也没有得到鉴定。为了研究N蛋白磷酸化修饰是否能对病毒的复制或N蛋白功能产生影响，本研究通过杆状病毒表达系统，成功表达出重组N蛋白，并通过离子交换层析和镍柱层析将重组N蛋白从裂解液中分离纯化。通过分析LC-MS/MS（liquid chromatography tandem mass spectrometry）质谱检测的结果，发现N蛋白的105位点和120位点的丝氨酸上存在有磷酸化修饰。通过反向遗传技术，将N蛋白第105和120位点的丝氨酸突变成丙氨酸，拯救突变体病毒，证实N蛋白的Serine105、Serine120磷酸化位点突变降低了病毒基因组、亚基因组水平及对仔猪的致病性。此外N蛋白的Serine78和Serine99位点突变降低了病毒的复制能力。以 PRRSV XH-GD 株 N 为诱饵，构建 PAM 细胞的 cDNA 文库，通过酵母双杂交技术筛选到 18个候选互作蛋白，探究了PCNA蛋白对PRRSV复制的影响机制。