基于原位点击化学技术研究bcl-2启动子G-四链体的细胞内定位及其调控基因转录的分子机制

Bcl-2 is a key oncogene in the tumor apoptosis signaling pathway. Our previous studies showed that the G-rich sequence in bcl-2 promoter can form a stable G-quadruplex structure, which plays key role in the regulation on gene transcription. In addition, the specific small molecular ligands can chemically interfere on this transcriptional regulation process. In situ click chemistry has been developed in the combinatorial synthesis of new selective inhibitors, and in the in vivo labeling and imaging of biomacromolecules as well. We recently designed and synthesized quindoline derivatives with alkyne side chains, which can be further conjugated with azine ligands to new G-quadruplex specific probes. This is also substantiation for further in vivo imaging and mapping of G-quadruplex DNA. Basing on these findings, this project is aiming to further optimizing the synthesis, evaluation, and in vivo detection of new probes using in situ click chemistry, thoroughly illustrating the existence of G-quadruplex in bcl-2 promoter and the molecular mechanism on the regulation of gene transcription, and discovering the relationship between G-quadruplex and gene transcriptional regulation and tumor apoptosis under the interfering of chemical probes. The results and conclusion of this project will help for illustrating the biological function of G-quadruplexes, and provide theoretical and directly experimental proof for identifying bcl-2 promoter as a new anti-cancer drug designing target.

bcl-2是肿瘤细胞凋亡通路中关键的基因。我们前期研究表明，bcl-2启动子区域存在的富G序列可形成G-四链体，在基因的转录过程中起着关键的调控作用，并发现特异性小分子配体可以对这一调控过程实施化学干预。原位点击化学技术可用于生物大分子高选择性配体的组合合成及生物大分子在细胞内的标记成像。近期，我们设计合成了炔基白叶藤碱衍生物，并在bcl-2 G-四链体催化下与叠氮化合物成功反应得到高选择性探针，为在细胞内实现对 G-四链体的成像定位提供了依据。本课题将在此基础上，优化和完善原位点击化学技术（新探针的合成、评价和实时检测技术），建立 G-四链体在细胞内的成像定位研究平台，并以此为基础研究bcl-2基因转录调控的分子机制；探讨化学干预对细胞内G-四链体的影响及其与基因转录和肿瘤细胞凋亡的关系。为阐明G-四链体的生物功能和确证bcl-2启动子作为新的靶向性抗癌药物靶点提供理论和直接的实验依据。

本项目全部完成了项目计划书中的实验内容，在此基础上也进行了研究内容的深入与扩充。主要进行了特异性G-四链体小分子配体的设计合成、作用验证及其在细胞内的成像研究；新型G-四链体抗体的发现、评价与细胞内的应用研究；G-四链体结构协同转录因子调控基因转录的机制研究；基于转录调控组件为靶点的化合物发现、评价及分子机制研究等工作。项目取得了一系列重要的成果，包括：通过点击化学技术得到了高选择性结合平行型G-四链体结构的新型白叶藤碱衍生物；发现首个特异性结合平行型G-四链体结构的高选择性抗体D1；利用抗体D1发现了癌细胞基因组内G-四链体的功能优势构象为平行型构象；提出基于转录调控组件的转录抑制剂设计新策略，并在此策略指导下发现了癌基因转录的高效抑制剂；以癌基因VEGF为研究对象，发现了具有新型作用机制的VEGF翻译抑制剂。这些研究为细胞水平上G-四链体结构的定位及功能研究、具有新作用机制的高选择性G-四链体小分子配体的设计与发现等领域提供了重要的理论和实验依据。目前，特异性抗体的应用及改造、转录调控组件的阻断剂优化改造以及特异性RNA G-四链体小分子配体等工作均在进行进一步的延续性深入研究，有望继续取得重要突破。项目的成果在国际权威期刊Cell Chemical Biology、Nucleic Acids Research、Journal of Medicinal Chemistry等上共发表标注引用的SCI论文10篇，其中第一标注5篇。项目共获4项中国发明专利授权。项目进行期间共培养3名博士生、3名硕士生。