小耳畸形高分辨率全基因组拷贝数变异序列特征分析研究

Microtia is a congenital anomaly of the outer and middle ear, caused by dysplasia of the first and second branchial arch during embryonic period . The incidence has been increasing year by year. Recent researches show that copy number variations (CNV) which is a form of genome structure mutations may play an important role in microtia. However, up to date, there haven’t been any related studies about large sample whole-genome CNV for microtia patients. In order to investigate the relationship between CNV and microtia, our research will continue to collect about two hundred microtia families to scan their whole-genome CNV. The control group is one thousand sporadic samples of microtia which have been obtained before. In this way we would identify potential pathogenic CNV. Then the pathogenic CNV would be verified in patients’ parents to estimate its origin and analyze if this pathogenic CNV is “de novo CNV” or not. Lastly we will use droplet digital technique to test recurred CNV in 1,000 sample cases of microtia patients which has been collected before. Preliminary tests in 22 cases of microtia patients have been conducted and the result was good which is in coincident with our hypothesis. Through these researches we may draw CNV map of microtia in Chinese population, which will provide theoretical basis for prevention and treatment, genetic counseling, assessment of recurrence risk and prenatal diagnosis of microtia.

小耳畸形是胚胎时期第一、二鳃弓发育异常引起的一组外、中耳畸形，发病率呈逐年增高趋势。近期的研究表明基因组结构异常之一的拷贝数异常（copy number variations,CNV）在小耳畸形的发病中具有重要作用，但目前尚缺乏大样本、高通量小耳畸形全基因组CNV的相关研究。为了深入探讨CNV与小耳畸形之间的相关性，本课题组拟在前期收集的1000例小耳畸形散发样本的基础上，继续收集200个左右核心家系进行全基因组CNV扫描，识别、鉴定出潜在致病CNV。在患者父母中进行验证，判断CNV来源，分析de novo CNV的致病性。应用收集的病例进行大样本量的验证，发现具有重现性的CNV。我们进行了22例小耳畸形核心家系患者的预实验，初步结果证实了我们的推测。本研究有望绘制中国人群小耳畸形的CNV图谱，为小耳畸形的防治、遗传咨询、疾病再发风险评估及产前诊断提供依据和理论基础。

先天性小耳畸形是重大的体表器官畸形之一，发病率约为5.18/万，且呈现逐年增高的趋势。先天性小耳畸形病因学机制虽未明了，但遗传物质突变是其重要发病因素。目前对于小耳畸形的致病基因鉴定主要集中于候选基因筛查研究。基因组拷贝变异作为另一类重要的遗传多态性已被证实在多种疾病的发生过程中起决定作用，在探讨疾病的遗传学改变时不容忽视。本课题实施过程中，首先选取在小鼠基因组信息学数据库中敲除后导致耳部畸形的基因中以及国内外文献报道和小耳畸形致病相关研究中选出HOXAI、HOXA2、EYAI、SIXl、SALLl、FGF3六个候选基因，通过在200例先天性小耳畸形患者中对上述候选基因测序分析及利用AccuCopyTM 多重DNA拷贝数检测方法检测拷贝数并验证。结果显示200例患者中有一例单侧散发患者存在HOXA2基因编码区c．260C>T(p．A87V)的突变，区别与先前文献家系中的研究结果。拷贝数检测结果显示两例患者存在EYAl基因拷贝数缺失。另外，本研究纳入19例散发样的小耳畸形合并先心病患者及1个核心家系，通过定制芯片捕获22q11.2区域（8Mb），利用高通量测序对该区域进行高深度测序。DELLY检测的结构变异提示，3个缺失片段和10个插入片段可能与疾病相关。其中缺失片段DEL00000583是一个375bp的缺失片段，在7个散发样中被检测到，该片段所在基因SGSM1被报道与心脏病相关；插入片段INS00000120在2例患者中被检测到，其所在基因CDC45位于小耳畸形经典病症的大片段变异区域内；另一插入片段INS00000368在2例患者中被检测到，所在基因MAPK1被认为与小耳畸形密切相关。CNVnator检测结果则提示7个片段可能与神经发育相关，其中重复片段DUP2所包含的基因CLTCL1影响神经发育，与室间隔缺损等疾病相关。DUP3所包含的基因SUSD2可以影响神经元生长。本研究共发表文章9篇，培养研究生3名，收集整理了我国宝贵的小耳畸形疾病资源，为其病因学研究奠定了理论基础和技术平台。