TGF-β1和CTGF基因对新疆驴真皮中Ⅰ型胶原蛋白的表达调控作用

Ejiao,which is an important traditional chinese medicine for both medicine and foods,has enormous social need. Because the donkey population has declined sharply in recently years,donkey's hide,which is unique production material for Ejiao,has been far behind the requirement. It is urgent problem to resolve that improving utilization rate of donkey's hide and developing a new method to produce Ejiao..The typeⅠcollagen of doney dermis is the main effective constituent of Ejiao, which would be different in various age of donkey dermis. .The TGF-β1 gene and CTGF gene are the key genes to regulate the expression of collagen in human skin. But for donkey, there is no relative report. This project will study changing regularity of type I collagen,age and the TGF-β1 and CTGF gene of Xinjiang donkey dermis using RT-PCR,Immunohistochemistry and Western blot. Our result will provided evidence to select optimal donkey's hide to produce Ejiao in production. At the same time,we will study the regulating relationship of the TGF-β1 and CTGF gene on collagen in donkey dermis using gene overexpressing method and gene siRNA technology. It will provided theoretical evidence to set up high efficient in vitro production system of donkey collagen.

阿胶是为我国药、食两用传统中药材，社会需求巨大。但近年来，由于毛驴的存栏数急剧下降，使得生产阿胶的唯一原料- - 驴皮产生了巨大的缺口；如何采用生物学手段提高驴皮的利用率和开发新的阿胶生产途径是急需解决的问题。驴真皮中的Ⅰ型胶原蛋白是阿胶的主要有效成分，其含量因驴皮的年龄不同而各异。.TGF-β1、CTGF基因是调控人体皮肤中胶原蛋白表达的关键基因，而对驴真皮中胶原蛋白的调控还未见报道。本项目将针对不同年龄段的新疆驴真皮组织，采用RT-PCR、免疫组化、Western blot技术，研究其Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量与年龄、TGF-β1和CTGF基因之间的变化规律，为生产中选择最佳取皮制阿胶的驴龄提供依据；同时结合基因过表达及siRNA干扰技术，对TGF-β1、CTGF与胶原蛋白表达量之间的调控关系进行研究，为将来在体外建立驴胶原蛋白的高效生产体系，提供理论依据。

以新疆驴真皮为研究对象，探究了不同年龄段驴皮中胶原蛋白形成基因mRNA的表达量及其蛋白含量的差异，确定宰驴取皮的年龄段；用组织块培养法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养，建立了驴皮成纤维细胞体外高效快速的培养体系；在体外培养的细胞中，发现TGF-β1、CTGF基因正向调控胶原蛋白的表达；具体如下：. 1、选取0-13岁各年龄段的新疆驴各5只，屠宰后取背部皮肤，检测胶原蛋白基因的表达量及其蛋白含量。对6-7岁年龄段新疆驴各部位皮肤进行HE染色与定量分析。并比较了不同动物背部皮肤中，胶原蛋白基因mRNA的表达量差异。结果表明，6-7岁年龄段的驴皮中胶原蛋白COL1A1、COL1A2基因的表达量及其蛋白含量显著的（P＜0.05）高于其它各年龄段；驴皮背部与颈部的胶原纤维密集且多，而脸部的疏松且少；成年驴皮中胶原蛋白的表达量显著高于（P＜0.05）小鼠、大鼠、猪皮中的表达量。. 2、选取6-7岁新疆驴真皮组织，分别用组织块培养法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养。结果表明，用0.25%的胰酶1h和0.5%的胶原蛋白酶Ⅰ6h先后处理驴真皮组织的双酶消化法培养3天后，成纤维细胞进入了对数增殖期，而组织快培养法则需要15天；细胞周期经流式分析发现，处于G0/G1期与S-G2-M期的细胞均接近一半，其余5.17±1.18% 的细胞处于凋亡期；试验中培养的细胞均无支原体污染。. 3、在体外培养的新疆驴真皮细胞中，分别通过过表达和干扰沉默TGF-β1和CTGF基因可提高和降低Ⅰ型胶原蛋白COL1A1、COL1A2基因mRNA及其蛋白的表达。. 综上，6-7岁年龄段的新疆驴背部皮肤中，胶原蛋白的表达量及含量最高，故此年龄段可作为宰驴取皮的最佳年龄段。应用双酶消化法可快速高效的建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。初步获得TGF-β1、CTGF基因对驴真皮中Ⅰ型胶原蛋白有正向调控作用。