家蚕微孢子虫Serpin家族表达特征及与宿主靶蛋白的互作研究

家蚕微粒子病是世界养蚕国家惟一的检疫对象，也是蚕业科学研究的重点和难点问题，其病原微家蚕微孢子虫。Serpin是最大的蛋白酶抑制物家族，抑制型serpin主要功能是抑制丝氨酸蛋白酶。在已公布的微孢子虫基因组中及相关文献中，都无微孢子虫serpin的报道。有趣的是，我们在家蚕微孢子虫基因组中注释出9个serpin，其中预测有4个有信号肽，可能为分泌型serpin。这些serpin的功能为何？有何表达特征？在与宿主免疫系统互作中扮演什么角色？是本项目要着力回答的科学问题。本研究以我们完成测序的家蚕及为研究材料，以家蚕及家蚕微孢子虫基因组为数据平台，采用原（真）核表达、免疫定位、GST-pull down、家蚕转基因等技术，研究在感染过程中serpin家族的时空表达特征、对宿主蛋白酶的抑制活性，分析其与宿主免疫系统互作关系，探索serpin家族在微孢子虫与宿主协同进化中的功能。

家蚕微粒子病是养蚕业的唯一检疫性传染病，家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是其病原。Serpin家族是微粒子属特有的蛋白家族，在N. bombycis中一共鉴定出19个成员。本项目对NbSPN6、NbSPN9、NbSPN13、 NbSPN14、NbSPN19进行了较为全面的研究。发现微孢子虫感染家蚕后，多数NbSPNs开始并持续转录；同时病蚕血淋巴黑化速度变慢，推测可能是Serpin蛋白参与了对家蚕黑化通路的调控。为了进一步证实我们的推测，我们通过杆状病毒表达系统成功表达了NbSPN13，发现其具有胰蛋白酶抑制活性。胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶的一种，而丝氨酸蛋白酶系统在黑化通路--多酚氧化物酶级联反应中扮演重要角色。同时发现，NbSPN6具有和孢壁几丁质层结合的活性，并且，该蛋白的天然形式表现出糖基化修饰的特征。免疫电镜定位结果表明NbSPN6在孢子的表面有明显的定位信号，与其能和孢壁几丁质层结合的特性吻合；NbSPN19的定位信号主要出现在原生质膜，而NbSPN9、NbSPN13、NbSPN14定位信号主要在孢子的细胞质出现, 同时我们也找到了NbSPN14, NbSPN19感染的家蚕组织中分泌的证据。采用GST-PULL DOWN 结合质谱分析了可能与NbSPN19和NbSPN14互作的靶蛋白，其中3个蛋白在NbSPN19、NbSPN14的互作条带中都出现，分别注释为SH3-domain 结合蛋白、毒力相关三聚体自转运蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，暗示NbSPNs可能参与信号传导进程。最后，成功构建了NbSPN19和NbSPN14的家蚕转基因细胞系和转基因家蚕，两株转基因细胞系都表现出增殖速度加快的特征，转基因家蚕的抗性还在研究当中。目前，Serpin进化和潜在功能分析的结果发表在BMC GENOMICS上，Serpin的转录特征以及血液黑化速度变慢的结果发表在PLOS ONE上，相关成果还在进一步整理和投稿当中。通过三年研究，我们对NbSPNs表达和定位特征有了深入的认识，确认了其对丝氨酸蛋白酶的抑制活性，获得了相应的转基因细胞和转基因家蚕，找到了可能与其互作的靶蛋白，率先在国际期刊上报道了微孢子虫Serpin的原创性成果，对国际微孢子虫Serpin的研究起到了一定的引领作用。