新型猪β防御素2的设计及其功能研究

由于抗生素的长期使用和滥用，不仅造成抗生素残留、并且使许多病源微生物对抗生素产生了耐药性，使得猪的发病率和死亡率居高不下，制约了养猪业的发展，也严重威胁着人类健康。防御肽对耐药菌株有杀灭作用，并且抗菌谱广、无免疫原性、无任何药物残留等优点，使其有望成为新型的抗菌制剂。猪β防御素2（pBD2）对临床分离的猪肠道致病菌有很强的抑杀作用，与猪分泌的其他防御肽相比，杀菌活性强，细胞毒性小，对猪病的防治具有重要意义。本课题组已经克隆了pBD2基因，证明其对致病菌有强烈的杀菌作用，为进一步提高其抗菌活性，本研究拟采用理性设计（定点突变）和非理性设计（随机突变、DNA改组）对pBD2基因进行突变研究，以期获得携带不同突变位点的pBD2基因的工程菌株，诱导表达并从中筛选抗菌活性大幅度提高的新型防御素，同时对其功能进行研究，进而分析与pBD2功能相关的关键氨基酸，为其在实践中的应用奠定基础。

由于抗生素的长期使用和滥用，使许多病源微生物对抗生素产生了耐药性，使得猪的发病率和死亡率居高不下，制约了养猪业的发展，也严重威胁着人类健康。猪β防御素2（pBD2）对临床分离的猪肠道致病菌有很强的抑杀作用，对猪病的防治具有重要意义。我们在克隆pBD2基因的基础上，应用理性设计和非理性设计对pBD2基因进行突变研究，并对其抗菌活性等功能进行了分析，结果如下：(1)采用定点突变技术，得到了9个突变基因，将其克隆表达，并分别对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus进行了抗菌活性分析。结果表明，I4R比pBD2的抗菌活性好，S15R的活性与pBD2相当，E24R和A32K具有较好的抗菌活性。其他的抗菌活性比pBD2低。(2)在单点突变的基础上，设计了6个组合的突变，同样进行了克隆表达和抗菌活性分析。结果显示，在高浓度时，Z4(I4R、S15R 和D1K组合5)和Z6 (D1K、I4R、S15R和E24R组合)的抗E. coli活性高于pBD2；Z1(I4R和S15R组合）、Z5(I4R、S15R和E24R）、Z6的抗S.aureus活性比pBD2高。但是综合分析差异不显著。(3)以抗菌活性较高的I4R、Z5和Z6为基础进行了定向进化研究，共得到160多个克隆，分析确定17个突变株，对其中的5株进行了诱导表达和抗菌活性分析，其抗菌活性未明显提高。(4)总的来说，抗菌活性随着浓度的升高而增加，随着时间的延长而降低。理性设计的突变蛋白溶血活性都低于12%，说明对血红细胞没有毒害作用或者说毒害作用很小。(5)离子浓度对I4R、Z5和Z6的抗菌活性结果显示，离子浓度不影响其对E.coli和S.aureus的抗菌活性，甚至对抗菌活性有促进作用。对Z5和Z6加热后进行抗菌活性分析表明，其具有良好的热稳定性。(6)对各个突变点的空间结构分析表明，所有突变点的二级结构均未发生明显变化，都是由相同的氨基酸组成1个α螺旋(His2-Lys8)和3个β折叠(Thr11-Asn13, Phe20-Tyr28 和 Lys31-Arg37 )。对其高级结构分析表明，N端的正电荷可能对抗大肠杆菌有重要意义，N端和C端的正电荷对抗金黄色葡萄球菌有重要意义。本研究为pBD2替代抗生素在猪病防治中的应用奠定了良好的理论基础，对其实际的应用提供了理论依据，为进一步研究奠定了基础。