三疣梭子蟹Ptngo基因在渗透压调节进程中的功能研究

The swimming crab, Portunus trituberculatus,is an important marine fishery and aquaculture species which belong to euryhaline species. The special molecular mechanism of osmoregulation is not yet clear in Portunus trituberculatus. Based on the preliminary study of comparative transcriptome, we found a novel gene which specifically expressed in the gills and eyestalks, involved in osmoregulation, and may be play an important function in the gill epithelial ion transport signaling pathway regulated by neuroendocrine system of eyestalk. In this work, we intend to identify the patterns of gene expression and subcellular localization by Real-time quantitative PCR, Western blot, In situ hybridization and Immunohistochemical techniques,study its interaction of molecular network with the major ion transport enzyme and neuroendocrine regulation mechanism by RNA interference technology and eyestalk ablation, detect SNP in Ptngo and research its associations with osmotic tolerance trait by association analysis. The study will enrich the contents of molecular mechanism of osmoregulation in euryhaline crustacean, help to understand the mechanism of osmoregulation regulated by neuroendocrine system of eyestalk, provide a scientific basis for water quality management in Portunus trituberculatus farming.

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国重要海水养殖品种，属典型广盐性蟹类，其特殊的渗透压调节分子机制尚不十分明确。基于前期比较转录组学工作基础，本研究拟对一个特异表达于鳃和眼柄组织、参与三疣梭子蟹渗透压调节进程、可能在眼柄神经内分泌系统调控鳃上皮离子转运信号通路中发挥重要作用的新基因Ptngo开展功能研究。通过实时定量PCR、Western Blot、原位杂交、免疫组化技术进行基因表达特征分析及亚细胞定位；通过RNA干扰技术和眼柄切除手术研究其与渗透压调节主要离子转运酶间相互作用分子网络关系并初步探讨其眼柄神经内分泌调控机制；发掘Ptngo基因SNP座位并通过关联分析检测其与渗透压耐受性状的相关性。本研究结果将丰富广盐性甲壳类动物渗透压调节分子机制的研究内容，有助于了解甲壳类渗透压调节的眼柄神经内分泌调控机制，为三疣梭子蟹健康养殖水质管理提供科学依据。

甲壳动物的渗透压调节机制一直是国内外学者研究的热点。基于前期比较转录组学工作基础，我们筛选到一个可能在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要功能的Ptngo新基因。在本课题的资助下我们深入开展了该基因的相关研究：克隆Ptngo基因cDNA全长，该基因cDNA全长2754bp，编码323个氨基酸。在UniProtKB蛋白库中进行BlastX比对，发现Ptngo基因几乎比对不到任何已知蛋白。通过SMART软件进行结构预测发现其N端具有信号肽，C端具有DUF1518结构域，中间有两个串联的DM13结构域组成，进化树结果显示Ptngo基因在DM基因家族中单独聚为一支，表明其可能为甲壳动物DM蛋白家族的一个新成员。Ptngo基因主要表达于鳃和眼柄组织中，原位杂交结果显示其特异表达于鳃上皮细胞中。进一步通过对Ptngo基因编码蛋白进行亚细胞定位分析，发现其有69.6%的可能定位于细胞膜上或胞外。盐度胁迫显著影响了Ptngo基因的表达模式，在低盐胁迫的早期下调表达，之后呈阶梯式显著上调表达，72h时上调表达至3.99倍。转入正常海水盐度后，Ptngo基因在6h时上调表达至峰值（8.81倍），随后（24-72h）恢复至对照组的表达水平，研究结果表明Ptngo基因在三疣梭子蟹高渗和低渗调节中均发挥重要作用。通过眼柄切除和注射眼柄粗提液两个实验，发现Ptngo基因的表达受到眼柄神经内分泌系统调控，推测眼柄神经内分泌系统能够合成或分泌某些激素或信号传导介质，促进Ptngo基因在鳃上皮细胞中的表达，且发挥调控的物质在三疣梭子蟹体内的效应期为48-72h。通过肌肉注射双链RNA的方法，成功建立了Ptngo基因的RNAi干扰技术。Ptngo敲降后Na+-K+-ATPase和V-ATPase基因的表达和酶活水平相应降低，初步证实了Ptngo基因可能为Na+-K+-ATPase和V-ATPase基因重要的上游调控因子。通过直接测序法发掘Ptngo基因两个SNP座位，并利用飞行时间质谱法在三疣梭子蟹耐低盐性状分离群体中验证了Ptngo基因与耐低盐性状显著相关。本项目的研究结果丰富了广盐性甲壳类动物渗透压调节分子机制的研究内容，有助于解析甲壳类渗透压调节的眼柄神经内分泌调控机制。