中国白酒的窖泥微生物群落结构及窖泥老熟与老化机理的免培养研究

中国传统浓香型白酒泥窖窖池微生态环境中，窖泥被认为是左右固态发酵白酒质量和风格的重要因素之一，但对窖泥质量性状的认识长期停留在经验判断基础上难以提升；白酒发酵过程低pH、高水分、高静压、兼性厌氧以及窖池周期闭合等特殊胁迫因素，给窖泥微生物提供了特殊的栖息环境，窖泥的老熟和老化均可认为是微生物区系发生变化的过程，通过特定分子指纹图谱的构建可望反映其规律性。核糖体小亚基rDNA限制性酶切分析、变性梯度凝胶电泳、实时定量PCR、分子克隆及系统发育分析等免培养分子生物学方法，可被用于不同窖龄窖泥的多轮次酿酒发酵分析，全面客观地探讨窖泥微生物菌群的基本构成及丰度变化趋势；通过对比分析，弄清白酒发酵窖泥微生物多样性的构成差异与窖泥老熟及老化的相关关系；通过构建窖泥主要优势菌或特征指示菌分子指纹图谱及其相关数学模型，可望为揭示窖泥质量性状与白酒风格质量的内在规律以及窖泥质量标准的建立奠定理论和技术基础。

窖泥是多种微生物的生长和繁殖载体，是我国浓香型白酒生产的关键材料。在长期的固态发酵、续糟工艺操作以及窖池周期闭合的影响下，窖泥微生态环境不断发生菌群演替，形成复杂的微生物多样性。随着窖池窖龄的延长，窖泥逐渐趋于老熟或老化，从而左右着传统白酒生产质量和风格的稳定性，但对窖泥质量的评判标准停留在经验判断基础上。本研究采用核糖体小亚基rDNA限制性酶切分析、变性梯度凝胶电泳、荧光定量PCR、分子克隆及系统发育分析等免培养技术构建不同窖龄、不同性状、不同轮次窖泥的微生物群落指纹图谱及建立了窖泥微生物的构成差异与窖泥老熟及老化的相关关系。结果表明，随着窖龄的增加，窖泥细菌和古菌的多样性均增加并趋于稳定，老熟窖泥细菌多样性高于老化窖泥，而古菌多样性呈相反趋势。窖泥主要细菌在厚壁菌门（Firmicute）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、 绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）以及一些未分类细菌（Unclassified Bacteria）中多有分布, 主要古菌则分布于广古菌门(Euryarchaeota)的甲烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷杆菌属(Methanobacterium)。窖泥指针微生物的荧光定量检测结果显示甲烷鬃毛菌属、互营单胞菌科、放线菌门在窖泥中随着窖龄增加而增加并趋于稳定，甲烷鬃毛菌属、互营单胞菌科、氨基酸杆菌属、放线菌门在老熟窖泥的含量均明显高于老化窖泥。荧光定量PCR检测结果显示氨基酸杆菌含量（A值）1×106copies/g窖泥、厚壁菌门copy数/拟杆菌门copy数（R值）10似乎可作为评价老熟老化窖泥的分界线，即氨基酸杆菌含量（A值）≥1×106copies/g窖泥时，可判断为老熟窖泥，其反之则为老化窖泥；R值＜10时，可判断为老熟窖泥，反之则为老化窖泥。同时，衡量窖泥质量的R值与白酒生产性能有直接的关系。通过发明一种筛选细菌新菌种的方法，成功从窖泥样品中分离到两株新菌种，开发了窖泥新生物资源。本研究结果既可为判断窖泥老熟老化性状提供理论和技术支持，指导生产预防窖泥老化，也可为提升中国传统白酒学术研究水平，继承和发展传统白酒的发酵工艺，提高中国传统白酒优质酒生产能力等起到积极的推动作用。