基于宏转录组学的窖泥老熟与老化形成机制及功能基因解析研究

Pit mud, a critical material for the production of Luzhou-flavor liquor, provides a suitable habitat for the growth and metabolism of microbes. During the long period of solid-state fermentation with the reuse of part of the fermented grains and the periodical closes of the pit, the microbial community in the pit mud changes continuously and becomes complex and diverse. With the increase of pit age, the pit mud gradually attains to aged or aging state, which affects the quality and the style of the liquor. Molecular biology technologies, such as metatranscriptome and reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR), can be used to reveal the evolutionary changes and the distribution of difference gene expression of active microflora in the aged and aging processes of pit mud. The correlation analysis of active microbes, their functional genes and the environmental factors is conducive to reveal globally the gene expression of microbes in pit mud and the response of the metabolic regulation to different environmental conditions, and to interpret the formation mechanism of the aged and aging pit mud. Meanwhile, the comparative analysis of functional genes of microbes, the screening and the heterologous expression of key genes which could regulate the aged and aging of pit mud may promote the formation of aged pit mud and prevent the aging of pit mud with the application of genetically engineered strains. This research may lay the theoretical and technical foundation for the improvement of pit mud quality.

窖泥是多种微生物的生长和繁殖载体，是我国浓香型白酒发酵过程参与代谢的关键材料。在长期的固态发酵、续糟工艺以及窖池周期闭合的影响下，窖泥微生态环境不断发生菌群演替，形成复杂的微生物多样性。随着窖池使用年份的增加，窖泥逐渐趋于老熟或老化，影响传统白酒生产质量和风格的稳定性。宏转录组、反转录实时定量PCR等分子生物学技术，可被用于表征老熟与老化过程中不同性状窖泥的活性微生物演替规律与差异表达基因的分布。结合活性微生物及其功能基因与环境因子的相关性分析，有利于全局反映窖泥微生物在基因表达和代谢通路调控水平上对不同环境条件的响应规律，揭示窖泥老熟与老化的形成机制；结合比较分析老熟与老化窖泥的功能基因，筛选出调控窖泥老熟的显著关键基因并进行异源表达，有利于借助基因工程菌促进窖泥的老熟和改善窖泥的老化，为提高窖泥质量奠定理论与技术基础。

窖泥作为影响浓香型白酒品质的重要材料一直受到白酒行业的广泛关注，其关键作用在于窖泥中包含的多种微生物及其代谢作用。然而，由于窖泥中的微生物群落结构极其复杂，代谢途径繁多，并且会受到环境因子的影响，导致窖泥影响浓香型白酒品质的机理一致不甚清晰。本项目通过现代生物学手段，解析了窖泥性质、窖泥微生物群落结构及主要代谢途径间的关系，对阐释窖泥作用机理具有重要的理论指导意义，对提高浓香型白酒品质具有重要的实践参考价值。.通过研究，我们发现：第一，不同性质窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）之间存在明显的理化、代谢产物和表面形貌等差异；结合窖泥原核微生物16S rDNA测序分析，可以构建窖泥微生物群落结构与环境因子之间的相关关系；进一步发现变形菌门和放线菌门可作为新窖泥的指针菌，梭菌、古菌和氨基酸杆菌可作为老熟窖泥的指针菌。第二，本研究率先建立了从窖泥中提取RNA和进行RT-PCR检测窖泥中mRNA的方法，利用提取到的RNA进行转录组测序分析，可观察到不同性状窖泥中活性微生物存在明显差异，并在转录水平证实了梭菌、古菌在老熟窖泥中非常活跃；基于转录组数据结合KEGG数据库，我们构建了老熟和老化窖泥中的关键产物（乙酸、乳酸、丁酸、己酸、辛酸、H2、甲烷）代谢途径，并通过两者代谢通路的差异分析，找到了与窖泥性质相关联的关键酶（甲基辅酶M还原酶、醇醛脱氢酶和苹果酸脱氢酶）和关键基因（mcrA、adhE和ME2）；并进一步通过qPCR和RT-qPCR的方法，对上述基于基因和转录水平分析得出的结论进行了证实；对筛选出的关键基因，成功地运用基因工程手段在E.coli BL21(DE3)中进行了异源表达，为构建基因工程重组菌在养窖护窖、促进窖泥老熟、防止窖泥老化等方面的应用打下了理论基础。第三，根据研究，证实了己酸和己酸菌对浓香型白酒风味物质形成所起到的关键作用；通过开发一种己酸菌评价培养基，并成功运用该培养基筛选到一株己酸产量高达10951.1 ± 823.4 mg/L的克氏梭菌B279-10-4-2-CC2，为今后利用己酸菌构建基因工程重组菌奠定了菌种基础。