基于液滴微流控的单细胞全基因组扩增技术研发

The single-cell genomics plays an significant role in revealing the evolution of tumor in the level of single-cell, giving many guidance and direction for personalized therapy and target medicine development. The most challenge and necessary key work before single-cell sequencing is the whole genomics amplification. Owing to that the content of DNA/RNA within a cell is rather few, the amplification may easily suffered from contamination in both environment and reagent. And the amplification bias brings great challenges for bioinformatics of single-cell. Droplet microfluidics fulfills the single-cell encapsulation in homogeneous nanoliter or picoliter droplets with high throughput, and it can also replace the hand-on sample injecting process by manipulating the droplet fusion, which make it possible for the multiple displacement amplification(MDA) of single-cell in a droplet. Furthermore, reducing the reaction volume of MDA into nanoliter level may be beneficial for the improvment of amplification bias, and the independent water-in-oil droplet microreactor may decrease the contamination as far as possible. Droplet microfluidics may substitute the traditional way of single-cell separation, and it gives some prospect of overcoming the bottleneck of the single-cell-sequencing throughput when the barcode is added in during the single-cell encapsulation. Droplet microfluidics may dramatically improve the single-cell genomics amplification quality, as well as bringing higher sequencing throughput.

单细胞基因组学研究可以在单细胞水平层面揭示肿瘤细胞的演化规律，对精准个体化治疗和靶向药物研发有重大指导意义。单细胞全基因组扩增是单细胞测序前的必经步骤，也是最核心的难点。因单个细胞中初始核酸含量极低，扩增过程极易受环境和试剂污染，并且容易产生扩增偏向，给后续的生物信息分析带来极大干扰。液滴微流控技术可以以很高的通量将细胞包裹在高度均一的纳升/皮升级别液滴中，通过操控液滴融合替代人工试剂加样过程，此两点为液滴内进行单细胞的多重置换全基因组扩增提供了可能。同时，将多重置换反应体积降低至纳升级别，有利于扩增偏向的改善，其特殊的独立的油包水液滴微反应器也可以将污染的影响降至最低。液滴微流控技术完全可以取代传统的单细胞挑取方式，还可以在细胞包裹过程中加入细胞编码，可以从根本上解决单细胞测序通量的瓶颈问题。可以预期，液滴微流控将会极大改善单细胞基因组扩增质量，也必将大幅度提升单细胞测序通量。

单细胞测序技术持续火热。2016年10月，由麻省理工学院-哈佛大学博德研究所（ the Broad Institute of MIT and Harvard）、维尔康姆基金会桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）和维尔康姆基金会牵头召开人类细胞图谱计划启动会议（Human Cell Atlas Launch Meeting），该计划可以和人类基因组计划相媲美，旨在创建一个系统性的、能够对人类细胞进行高度分类的细胞图谱，该计划将单细胞相关的基础研究推向一个新的高潮。. 单细胞测序首先需要解决的技术难题是如何高通量的分离捕获单细胞。本项目紧紧围绕单细胞测序中最为关注的高通量问题展开一系列基础研究，基于液滴微流控技术，借助于带有唯一分子标识的（UMI，Unique molecular identifier）微米级珠子，致力于提升同一个液滴内共包裹一个珠子和一个细胞的比例。我们优化了微流控芯片的设计，利用Dean惯性流动迫使细胞和珠子在微尺度流道内整齐排列，将液滴内部同时包裹一个珠子和一个细胞的包裹比例从0.15%提升到20%。基于此芯片，我们摸索了在液滴内进行逆转录的方法，随后收集将其环化建库形成DNB（DNA nano ball），在国产测序平台BGISEQ-500上建立了一整套单细胞 RNA Drop-Seq的标准流程，实现了每个run超过10000个细胞的基因表达量分析，完成了本项目的预计目标，极大地提高了单细胞分析的通量，该技术具有广阔的科研和临床应用前景。. 同时，本项目组按项目预定计划搭建了基于流式细胞仪的荧光液滴筛分系统，成功应用于一体化的液滴数字PCR（ddPCR），相关文章已经发表于微流控顶级期刊《Lab on a Chip》。项目组目前仍在继续开发基于母液滴被动分裂的提高细胞包裹率的技术，和基于液滴微流控技术的单细胞全长RNA的测序技术。