液滴微流控技术用于高通量单细胞分析

本项目将发展液滴微流控技术并用于单细胞基因的高通量分析研究。该课题将建立微流控技术用于快速生成粒径均一、热稳定性好的纳升级油包水液滴。所设计的芯片允许在液滴的产生过程中把单个细胞及标有PCR引物的单个微球分配到各个液滴中,实现对单细胞的快速分离。所产生的每一个液滴可以作为单独的反应腔体进行PCR或反转录PCR 反应，对细胞中所感兴趣的DNA/mRNA序列在微球表面单克隆放大，在微球表面上生成百万条以上与细胞内核酸序列相同的核酸序列。结合核酸特异性标记技术，利用流式细胞仪对微球上的放大产物的快速定量定性分析，实现对单细胞中的具体基因信息如DNA变异情况、mRNA表达水平的准确快速表征。该项技术可用于检测大量正常细胞中少数DNA突变、mRNA表达变异的疾病细胞或致病细菌，为肿瘤的早期快速诊断、重大传染病的预防提供了一种新方法、新技术。

本课题原计划要点主要包括三个方面：A. 设计、评估和优化可产生纳升级油包水液滴的微流控芯片，建立和系统优化液滴微球PCR方法； B. 建立单细胞液滴PCR方法与发展单细胞检测技术，并将单细胞液滴PCR技术用于癌症的早期检测；C. 建立单细胞液滴RT-PCR方法与发展单细胞检测技术，并将单细胞液滴RT-PCR技术用于癌症的早期诊断与药物筛选。我们按计划发展了新型的液滴微流控体系即琼脂糖液滴微流控技术，并对琼脂糖液滴PCR进行了系统优化，实现了单分子高通量PCR放大；在此基础上建立了琼脂糖液滴微流控单细胞高通量检测方法，并实现了痕量致病细胞在高背景下的高灵敏单细胞水平计数检测；发展了单细胞液滴RT-PCR技术，对不同肿瘤细胞实现了单细胞水平的高通量基因表达分析。此外，根据所建立的体系，我们增加了利用液滴体系进行核酸适体筛选的工作，发展了一种高效的核酸适体筛选方法；同时建立了基于液滴微流控的单个酶分子检测方法，实现了酶分子的数字化计数检测。综上，我们圆满地完成了原计划的全部内容，并在此基础上拓展了新的研究内容。.课题的预期目标是发展一项可用于单细胞基因组高通量分析及癌症早期检测的微流控芯片液滴技术。预计在国际知名化学学术刊物上发表高质量研究论文 3 篇以上，申请专利 2 项，培养出 3-5 名微流控芯片方向的科研人才。目前通过该课题的研究，建立了液滴琼脂糖单分子PCR方法，实现了高通量单细胞PCR和RT-PCR的方法，建立了基于单分子放大的核酸适体筛选新技术，并在国际化学期刊上发表SCI论文23篇，其中影响因子5.0以上20篇，包括2篇JACS，2篇Lab Chip，6篇Chem Comm，6篇Anal Chem, 2篇Chem Eur J 和 1篇Biosen Bioelectron。申请国家专利2项，培养了生物分析化学博士3名，硕士12名。