适用于单细胞全基因组扩增的微流控交流电喷雾方法研究

Single-cell sequencing has emerged as a powerful technology in personalized medicine, especially in cancer diagnosis and treatment. However, a major challenge in single-cell sequencing is the common amplification bias in the pre-amplification process, resulting in low quality sample library construction. The currently proven solution is to disperse the sample into a large amount of droplets during the amplification, but conventional droplet generation technique has the limitation in droplet size, which can only generate down to about 20 μm droplets, and total droplet number can only be up to 105, so that the nucleic acid pieces cleaved from the genome could only be kept at 10 kb level, leading to nonnegligible amplification bias. Here, we propose an innovative method to produce droplets of less than 10 μm in diameter by AC electrospray, thereby producing more than 106 monodispersed droplets in a high-throughput manner to encapsulate nucleic acids. This method can maximally overcome the amplification bias, generating more even amplification result, and obtain a high-quality sequencing library. Solving the bias problem of single-cell whole genome amplification will improve the accuracy of single-cell sequencing analysis, thus facilitating personalized medicine such as early tumor screening and prenatal diagnosis.

单细胞测序技术在个体化医疗，尤其是肿瘤诊断和治疗等重要领域已经发挥出越来越强大的作用。然而，制约单细胞测序广泛应用的一个关键问题是在测序前的预扩增过程中，存在比较普遍的扩增偏见问题，从而导致样品文库的整体质量不高。目前已经得到证实的解决方法是将样品原液分散成多个液滴以使得每个核酸片断独立扩增，但传统的液滴生成技术有液滴大小的下限，只能稳定生成20μm左右的液滴，液滴数量只能达到10^5水平，因而基因组断裂的片断只能保持在10kb左右的尺寸，导致扩增偏见没有得到有效的抑制。我们提出利用一种创新的交流电喷雾方法制备出小于10μm直径的液滴，从而可以高通量地生成超过10^6的单分散液滴，最大限度地克服扩增偏见，使基因组的扩增效果更加均匀，以获得更高质量的测序样品文库。解决单细胞全基因组扩增中的偏见问题，将有助于实现更精准的单细胞测序分析，从而为肿瘤早筛、产前诊断等个体化医疗提供便利。

数字PCR作为强有力的第三代测序手段，在单细胞测序研究领域，尤其是肿瘤诊断和治疗等重要的应用领域已经发挥出越来越强大的作用。微流控凭借其模块化、集成化、功能多等特点，可作为一种辅助技术手段广泛地应用于数字PCR研究。本项目将交流电喷雾技术与微流控技术有机结合起来，建立了一种超小液滴发生微流控系统，并成功应用于数字PCR研究。我们基于交流电喷雾技术，通过调节微流控芯片内交流电场强度和频率，可在近三个数量级范围内产生尺寸可控、高度均一性的液滴，其直径可在0.8-40.1 μm范围内任意调节，相比传统基于微流芯片的直流电液滴生成技术优势明显。将该技术方案应用于数字PCR中时，可在3.3 fM-0.83 pM范围内，使阳性液滴数量与核酸浓度呈现良好的相关性，验证了其在数字PCR领域中可观的应用潜力。此外，基于本项目支持，我们还开发了一套种简易、扩展性强的荧光微球制备方法，用于合成尺寸可控的不同种类荧光水凝胶微球。利用本方法制备的微球，具有良好的荧光性质和单分散性，平均直径的变异系数小于2.1%，显著优于绝大多数同类方法。项目执行期间，共发表SCI学术论文4篇（已标注项目号），其中3篇作为JCR一区期刊的封面文章发表，申请发明专利5项。培养客座硕士研究生1名，较好的完成了项目的预定目标。