基于神经细胞钠离子通道为靶点的雪上一枝蒿毒-效关系研究

雪上一枝蒿为毛茛科乌头属植物，有祛风除湿止痛，止血散瘀的功效。其有毒生物碱同时具有不同程度的镇痛、抗炎等生物活性。神经细胞电压依赖性钠离子通道可以作为其毒性靶点。本项目旨在根据现代药理学应用于传统药物研发的基本模式，围绕雪上一枝蒿生物碱的神经毒作用及机制，采用膜片钳实验技术和整体动物实验，将雪上一枝蒿生物碱活性部位进行药效学及毒理学初步筛选，并对候选活性组分进行组效研究，探讨雪上一枝蒿生物碱活性成分群的"量-毒-效"关系，最终获得组成稳定，且又能符合组效关系的雪上一枝蒿活性组分群。并进一步利用流式细胞术、荧光分析、实时荧光定量等细胞分子生物学技术，观察其生物碱活性成分对神经细胞活力、凋亡影响，以及对细胞内钙离子和氧自由基水平的调控作用，探讨雪上一枝蒿所致神经毒性的信号转导通路，在分子水平阐明其神经毒-镇痛效应的关系及毒性机制。为雪上一枝蒿临床用药的有效性和安全性提供理论指导。

雪上一枝蒿为乌头属植物短柄乌头的干燥块根。有祛风止痛，止血散瘀的功效。该药材不仅具有强大的镇痛作用，同时也存在严重的毒性反应。神经细胞电压依赖性钠离子通道可以作为其毒-效靶点。本项目旨在根据现代药理学应用于传统药物研发的基本模式，围绕雪上一枝蒿的神经毒作用及机制，采用多种实验技术手段，初步筛选其活性部位，探讨活性部位的量-毒-效关系，并进一步研究其神经毒作用及机制。.研究结果如下：.1、系统提取分离其活性部位并进行HPLC分析。急性毒性研究表明，氯仿部位的LD50为37.514 mg/kg，明显低于正丁醇部位的5492.337 mg/kg和石油醚部位的6766.928 mg/kg。雪上一枝蒿总提物及氯仿部位（5~20 mg/kg）对中枢性疼痛及炎性疼痛动物模型均有较好的镇痛作用，但安全范围较窄，20mg/kg以上的浓度即开始出现毒性反应。.2、膜片钳实验证实，雪上一枝蒿醇提物在一定浓度范围 (0.01-1 mg/mL) 对大鼠DRG细胞电压依赖性TTX-S钠离子通道最大电流均有不同程度的抑制作用，从而发挥镇痛作用。但是，2 mg/mL的醇提物对电压依赖性钠离子通道的最大电流的作用却相反。2-8 mg/ml 醇提物能够剂量依赖性促进电压依赖性钠离子通道的最大电流，可能与其毒性作用有关。各个活性部位对钠离子通道作用筛选结果表明，雪上一枝蒿乙酸乙酯部位和氯仿部位在一定范围内（0.1-0.5 mg/mL）均有不同程度抑制钠离子通道的作用，氯仿部位的活性较强，与动物筛选实验结果一致。.3. 细胞体外实验证实雪上一枝蒿醇提物具有抗炎作用。其机制与抑制LPS所致的巨噬细胞分泌活性氧和一氧化氮有关。其醇提物及不同提取部位可不同程度抑制SP20、HepG2及Hela肿瘤细胞增殖，但相同剂量范围内（> 62.5 μg/mL），对正常Vero细胞也具有一定毒性。其中，氯仿和石油醚部位毒性最强。.4. 雪上一枝蒿可增加PC12细胞内多巴胺的释放，引起多巴胺能神经的氧化应激从而诱导细胞凋亡产生神经毒性。黄芩苷和甘草次酸通过清除细胞内的活性氧，降低胞内钙离子的释放，提高细胞的存活率，从而达到解毒的作用。.结论：雪上一枝蒿氯仿部位乌头类生物碱含量最高，是雪上一枝蒿主要毒性和活性部位。在一定剂量范围内，它具有镇痛、抗炎、抗肿瘤作用。其量-毒-效关系研究对临床具有一定的借鉴意义。