十字花科黑腐病菌XopLRXcc效应物抑制拟南芥免疫反应的机理研究

The type III effectors of many phyto-pathogenicbacteria play the crucial rules in the interactions between the bacteria and their host plants. It is very important to identify the host targets of the effectors and study the mechanism of their interaction. Our previous work demonstrated that the effector XopLRXcc with LRR domains，translocated by the crucifer black rot agent Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) , was required for the full virulence of this bacterium. A candidate plant target of XopLRXcc was identified and confirmed. On the basis of these results, we would like to carry out the experiments below: (1) to study the function of LRR domains in the interaction between XopLRXcc and its target protein; (2) to localize the subcellular localization of XopLRXcc-target gene and to test its expression pattern by using the molecular technologies; (3) to study the biochemical characteristics of target porein by expressed and purified it in vitro; (4) to assess the function of XopLRXcc-target gene, XopLRXcc-targeted gene deletion mutant plant, over-expression transgenic plant and the control plant were constructed. After infected by different Xcc mutant strains, the pathogenic phenotype, expression of plant defense genes, changes of callose deposition and reactive oxygen species, host plasma membrane H+-ATPase activity were studied. It is expected to elucidate the interaction mechanism of the XopLRXcc and its host target, laying a foundation for developing the novel methods in plant disease control.

植物病原菌的III型效应物在病原菌与寄主相互作用中发挥决定性作用。鉴定效应物的寄主靶标并研究它们相互作用的机理，具有非常重要的意义。我们前期研究在十字花科黑腐病菌中鉴定了一个含有LRR结构域的效应物XopLRXcc，发现它能抑制寄主植物拟南芥的免疫反应，并筛选和验证了它的寄主靶标。因此，本申请项目拟开展：（1）研究LRR结构域在效应物与寄主靶标互作中的作用；（2）通过分子生物学技术研究该靶标基因在植物中的亚细胞定位及时空表达模式；（3）通过体外表达、纯化该靶标蛋白，分析其生化特性；（4）构建 XopLRXcc 寄主靶标基因的过量表达转基因株系和缺失突变体，通过不同株系中病原菌的致病力比较，植物防卫相关基因等的表达变化，胼胝质沉积以及活性氧的变化，寄主质膜H+-ATPase的活性比较等实验，研究该寄主靶标基因的功能，从而揭示XopLRXcc与其寄主靶标互作抑制寄主植物免疫反应的机理。

植物病原菌的III型效应物在病原菌与寄主相互作用中发挥决定性作用。鉴定效应物的寄主靶标并研究它们相互作用的机理，具有非常重要的意义。我们前期研究在十字花科黑腐病菌（Xcc）中鉴定了一个含有LRR结构域的效应物XopLRXcc，并通过酵母双杂交初步筛选和验证了它的寄主靶标PPI1。因此，本研究利用Xcc与模式植物拟南芥的互作系统，在不同层面上揭示了XopLRXcc在病原菌与寄主植物互作过程中的基因功能和作用机理。主要研究结果如下：（1）在Xcc8004缺失已知17个效应物的突变体Δ17E菌株中研究XopLRXcc的功能，结果表明XopLRXcc是Xcc 8004侵染拟南芥的重要致病因子，能抑制寄主植物的模式分子诱导的免疫反应（PTI），促发效应物诱导的感病反应（ETS）；（2）通过BiFC进一步验证XopLXcc与PPI1可以在寄主细胞内直接结合，并明确LRR 结构域在XopLXcc与寄主靶标相互作用中起重要作用；（3）通过体外表达、蛋白纯化，研究了XopLRXcc寄主靶标PPI1的生化性质，并证实其参与寄主植物免疫反应；（4）通过对该寄主靶标的缺失突变体、过表达转基因和对照植株在Xcc不同突变菌株侵染下的表型分析，植物防卫相关基因等的表达等，解析了XopLXcc通过与其寄主靶标蛋白PPI1互作从而抑制寄主免疫反应的机理。综上所述，该项目结果进一步确证了XopLXcc在寄主植物拟南芥中的靶标PPI1，揭示XopLXcc与其寄主靶标PPI1互作抑制寄主植物免疫反应的机理，即靶标PPI1在植物免疫反应中了发挥重要作用，而XopLXcc主要通过与其结合来抑制PPI1的功能，从而对Xcc致病力起贡献作用。鉴于XopL类效应物蛋白在黄单胞杆菌属中非常保守，在病原致病过程中发挥重要作用，其寄主靶标及作用机理的研究对相关病害的防治和植物分子育种具有重要的理论意义，对防治病害具有重要的理论意义与潜在的应用价值。