十字花科黑腐病菌一个新的III型效应物基因的功能鉴定

多数植物病原细菌依赖III型分泌系统向寄主细胞内转运效应物蛋白，起抑制寄主的先天免疫反应或激发寄主抗病反应的作用。前期，我们从十字花科黑腐病菌8004菌株的HrpG调控元中鉴定了一个具有富含亮氨酸重复结构域（LRR）的III型效应物基因xopXccLR。实验表明，该基因的突变体致病力显著下降，提示该基因在致病中发挥重要作用。本申请项目拟首先通过体外表达、纯化该效应蛋白，分析该蛋白的生化特性；再采用绿色荧光蛋白融合表达方法对该蛋白在植物细胞内进行亚细胞定位；并采用酵母双杂交技术、免疫共沉淀或BIAcore方法鉴定该效应物的寄主靶标蛋白及基因；构建寄主靶标基因的RNAi干扰或过量表达植株，研究寄主靶标基因的功能及其与该效应物之间的互作关系，分析该效应物激发的信号转导途径。从而鉴定xopXccLR基因的功能，并分析其在抑制寄主先天免疫反应中的作用机理，为阐明病原细菌的致病机理奠定基础。

十字花科黑腐病菌（简称Xcc）是一种能在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的病原细菌，其三泌系统效应物（T3SE）与病菌的致病机制相关。Xcc 8004菌株的xopL基因编码一个含有三个富亮氨酸重复结构域（LRR）的non-tal类效应物。实验表明，该基因的突变体致病力显著下降，提示该基因在致病中发挥重要作用。本课题通过生物信息学分析和蛋白质体外表达实验，初步弄清了XopL蛋白质的结构域和基本理化性质。采用PEG介导转化拟南芥原生质体，瞬时表达绿色荧光蛋白，明确了XopL效应物主要定位于植物细胞核中。采用酵母双杂交法，初步鉴定了XopL效应物的寄主候选靶标基因7个。采用PEG介导的原生质体转化法，瞬时表达xopL基因，发现XopL效应物能显著抑制flg22诱导的拟南芥先天免疫反应相关基因的表达。通过对xopL转基因植株的接菌实验分析，发现xopL转基因植株中病菌的数量比对照植株中显著增加，xopL转基因植株的病斑明显大于对照组。苯胺蓝染色结果显示，xopL转基因植株叶片中flg22诱导的胼胝质沉积显著低于未转基因的植株。上述研究结果表明，XopL效应物对拟南芥先天免疫反应具有显著抑制作用，能促进Xcc 8004对拟南芥的侵染，在Xcc的致病机制中发挥重要作用。