天蓝色链霉菌线型质粒SCP1的复制与接合转移

链霉菌属于高GC含量、产生菌丝体和孢子的革兰氏阳性细菌。在链霉菌的不同种中发现了约6600种抗生素和药理活性代谢物，约占全部微生物天然药物的一半。前人在模式菌- - 天蓝色链霉菌的巨大线型质粒SCP1上鉴定了1个复制区，我们近期的工作显示SCP1上存在3个不同的复制区。本项目拟在遗传和生物化学水平上精细分析这3个复制区，包括鉴定最小复制功能区、复制基因的转录起点、复制蛋白与非编码DNA序列的相互作用。通过连续敲除1个和2个复制区，以及在SCP1不同位置进行人工环化，获得的突变体与天然SCP1比较在遗传的稳定性和拷贝数方面的变化。鉴定SCP1上参与质粒稳定分配和接合转移相关的基因。在此基础上，尝试利用SCP1发展大片段DNA克隆和转移系统。

前人的研究鉴定了天蓝色链霉菌质粒SCP1上一段5.4kb区域为复制区，而我们的研究则显示SCP1上含有3个复制区域。在该研究中，我们将前人鉴定的5.4kb的复制区减小为3.2kb，同时鉴定了两个新的复制区，其中所包含的两个复制蛋白rep2A和rep3A与链霉菌质粒pZL12的复制蛋白相似，然后对这三个复制蛋白的转录起点进行了鉴定。通过研究发现，这三个复制区均能够以线型的形式在链霉菌中进行独立复制。rep1A和rep3A能够被单敲除和连续敲除，敲除rep1A或者rep3A的SCP1能够在天蓝色链霉菌中进行增殖，并且拷贝数基本没有变化，同时其遗传稳定性和接合转移效率与SCP1基本相同。我们将SCP1进行人工环化，得到一个280kb的环型SCP1，命名为C-SCP1，C-SCP1包含了3个复制区。对C-SCP1的拷贝数，稳定性及接合转移效率进行测定，发现C-SCP1的这些性状与线型SCP1是相似的。同时，选取菌株的各个生长状态，测定线型SCP1和环型C-SCP1中rep1A，rep2A和rep3A基因转录的情况。同时以同源重组为基础，通过“加减法”将 81kb的阿维菌素生物合成基因簇及76kb的多杀菌素生物合成基因簇克隆到质粒SCP1上，并且在宿主菌中检测到了异源表达的阿维菌素，成功建立了大片段DNA克隆系统。