链霉菌大的环型质粒pZL1接合转移和复制

在前期的工作中，我们从约200株中草药植物内生链霉菌中克隆和测序了6个80-130 kb的大的环型质粒。分析发现质粒pZL1（127862 bp）上携带了一个基因簇，编码与其他细菌同源的"四型分泌系统（T4SS）"，这是在链霉菌中首次发现类似大肠杆菌F质粒的接合转移基因簇。本项目拟通过敲除和克隆该基因簇，确定是否具有接合转移功能；标记T4SS关键蛋白，检测其在细胞中的定位；检测基因簇编码的蛋白是否形成复合体。此外，鉴定质粒上新的复制元件,并初步构建容纳DNA大片段插入的载体。

革兰氏阴性菌和单细胞革兰氏阳性菌中，质粒的接合转移通过IV型分泌系统（T4SS）来进行。T4SS包括三个主要组成部分， relaxosome, coupling protein和membrane pore。而多细胞革兰氏阳性菌中，质粒的接合转移则是通过FtsK/SpoIIIE 家族的转运因子来进行。我们在链霉菌质粒pZL1中发现了上述两种接合转移系统，这是首次在多细胞的革兰氏阳性菌中发现T4SS。虽然pZL1上有9个基因都类似T4SS蛋白（如relaxase即TraA, coupling protein即VirD4, membrane proteins即VirB4和VirB6等等），经过我们的实验验证，其中只有3个蛋白（traA,virD4和pZL1.42)）对于质粒在变铅青链霉菌中的接合转移是必需的。同时还鉴定了ftsK/spoIIIE类似系统的接合转移功能。这两套接合转移系统都能够促进质粒的接合转移，它们的作用也是相互独立的。而与其他菌中的T4SS不同的是，pZL1上的T4SS中的膜孔，要么由质粒上的基因编码简化的膜孔，要么膜孔由染色体上的基因编码。