携带Glycodelin-A通用型CAR-T避免被宿主NK细胞免疫清除的研究

Universal CAR-T (UCAR-T) cells overcome the immune rejection of host T lymphocytes by knocking out MHC-I signaling molecules, but are cleared by host NK cells, affecting their effectiveness. Therefore, the technical way to avoid NK cell killing is the key to the successful application of UCAR-T. The decidual tissue in normal pregnancy is enriched with a large number of decidual NK (dNK) cells, which together with the membranous glycoprotein Glycodelin-A (GdA) play an immunosuppressive role to protect the semi-allogene fetus from rejection by the mother. Our previous work confirmed that GdA can inhibit the cytoxicity of NK cells in vitro. It has been reported that GdA can induce differentiation of peripheral blood CD56brightNK cells into dNK cells. Can UCAR-T expressing GdA are able to escape NK cell clearance from host? In this study we try to construct a UCAR-T cell model expressing GdA, and to demonstrate whether this GdA+UCAR-T cells can inhibit the activity of cytotoxic NK cells, induce the enrichment or differentiation of regulatory NK cells, and mediate the immune tolerance of NK cells to host by in vitro and in vivo functional experiments. Thus solving the technical bottleneck of UCAR-T cell optimization, provides a new opportunity for the successful application of clinical UCAR-T.

通用型CAR-T（UCAR-T）通过敲除MHC-I信号分子克服宿主T淋巴细胞的免疫排斥，但会被宿主NK细胞清除，影响其有效性。因此避免NK细胞杀伤的技术途径是UCAR-T成功应用的关键。正常妊娠时的蜕膜组织中富集了大量蜕膜NK(dNK)细胞，与蜕膜糖蛋白Glycodelin-A(GdA)共同发挥免疫抑制作用，保护半同种异体胎儿不被母体排斥。我们前期工作证实了GdA在体外能够抑制NK细胞的杀伤毒性，有报道GdA能诱导外周血CD56brightNK细胞向dNK细胞分化。那么携带GdA的UCAR-T能否逃避宿主NK细胞清除？本研究拟构建携带GdA的UCAR-T细胞模型，通过体内外功能实验明确携带GdA的UCAR-T细胞能否抑制NK细胞的杀伤活性，诱导调节性NK细胞的富集或分化，介导对宿主NK细胞的免疫耐受，从而解决UCAR-T细胞优化的技术瓶颈，为临床UCAR-T的成功应用提供新的契机。

通用型CAR-T(UCAR-T)凭借其低成本及现货供应的特点，将是未来CAR-T细胞免疫治疗发展的主要趋势。前期工作中，我们通过敲除T细胞上编码β2-微球蛋白的B2M基因，阻止功能性HLA-I类分子在UCAR-T细胞表面表达，克服宿主T淋巴细胞的免疫排斥。然而，由于HLA-I是NK细胞的抑制性配体，它的缺失会激活患者NK细胞，并对异源UCAR-T细胞进行清除，使其在体内的扩增受限。子宫蜕膜组织中的蜕膜糖蛋白Glycodelin-A(GdA)具有免疫抑制作用，本研究拟明确携带GdA的UCAR-T细胞能否抑制NK细胞的杀伤活性，介导对宿主NK细胞的免疫耐受。本研究通过构建稳定表达GdA的细胞模型，在体外功能实验中证实携带GdA的细胞系能够部分抑制NK细胞的脱颗粒活性和杀伤功能，且对NK细胞亚群比例没有明显影响，但不并能完全抑制NK细胞的杀伤及激活，对活化的NK细胞扩增的抑制作用也有限。此外，过表达GdA的细胞系模型分泌的GdA蛋白，不能显著降低NK细胞的杀伤功能。因此，通过过表达GdA的方式优化TRAC/B2M基因敲除的UCAR-T细胞，仍存在较高的被宿主免疫清除的可能性。由于实验数据与预期假设不符，我们及时调整避免通用型CAR-T避免被宿主NK细胞免疫清除的基因编辑策略，借鉴母胎免疫及肿瘤免疫逃逸中独特的HLA-I表达模式，成功构建了联合CRISPR-CAS9技术靶向敲除HLA-A、B和TRAC基因的UCAR-T细胞。并在体外实验中验证了该UCAR-T细胞能够成功降低NK细胞的脱颗粒活性，且较B2M敲除的UCAR-T细胞具有更好的体外扩增能力。我们的研究发现为揭示影响UCAR-T功能的关键因素提供了重要证据，并为我们未来的UCAR-T治疗提供了新的对策。在研期间，已接收/发表论文4篇，均为第一标注，另一篇修回中。