基于液滴微反应器的集成化PCR-RFLP基因突变检测平台的建立及在大肠癌靶向治疗中的应用

Molecular targeted therapy is currently the most effective way of treating metastatic colorectal cancer. Because the patients harboring mutations in genes such as K-ras cannot benefit from the treatment, it is necessary to develop highly effective detection methods to screen the gene mutation status of the patients to facilitate personalized treatment. However, methods currently in use are not able to reveal mutations efficiently due to low sensitivity, high sample and time consumption, and failure to test therapy-related genes simultaneously. To this end, in previous work, we transplanted PCR-RFLP, a method for detecting gene point mutations, onto microfluidic chip and achieved a significant increase in sensitivity. To further enhance the ability to rapidly detect and parallel analyze trace amount of samples, this study focuses on developing an integrated PCR-RFLP platform based on microfluidics droplet by combining whole analysis process together, including DNA extraction system which can perform mini DNA preparation automatically, multiple droplet array which can sequentially fulfill PCR amplification and enzyme digestion processes for different samples, and capillary electrophoresis system which can continuously introduce and analyze samples in droplets. The established platform can be utilized to test mutations of several genes related to targeted therapy in tumor tissue and paired serum of colorectal cancer patients, providing additional insights to the personalized therapy of cancer.

分子靶向治疗是目前大肠癌最有效的治疗策略，但如果病人的某些基因存在突变，则靶向治疗无效，因此，亟需发展高效的检测方法筛查病人的基因突变状态，以准确指导临床个体化的用药。目前采用的突变检测方法存在灵敏度低、样品用量大、操作繁琐费时等问题，而且难以对相关的多个基因进行同时检测。为此，前期工作将基因突变检测方法PCR-RFLP中的电泳分离操作移植到微流控芯片上进行，显著提高了突变检测灵敏度。为了进一步提高其对微量样品的快速检测能力和多指标平行分析能力，本研究拟利用微流控液滴技术能够连续操控多个不同微反应单元的优势和高通量分析能力，创建基于液滴的集成化PCR-RFLP系统，即自动化完成基于液滴的微量DNA样品前处理；连续完成多样品阵列式液滴PCR扩增和酶切反应；进行液滴内多样品的连续自动进样和毛细管电泳分析。应用于大肠癌肿瘤组织和血液中靶向治疗相关基因的检测，为指导肿瘤个体化治疗提供高效技术平台。

靶向治疗是目前多种肿瘤特别是转移性肿瘤最为有效的治疗策略，但研究表明，靶向治疗疗效与患者多个特定基因的突变状态相关，因此，准确、高效地进行患者的基因突变状态检测特别是靶向治疗相关基因突变的联合检测，对提高靶向治疗疗效具有重要意义。为此，本研究利用液滴技术和微流控技术的优势，以大肠癌靶向治疗相关基因作为研究对象，创建了集成化的液滴PCR-RFLP基因突变检测系统，实现了对纳升级样品从细胞裂解到基因突变状态判断全过程的自动化、连续进行，并成功应用于对大肠癌靶向治疗相关的K-ras、B-raf、PIK3CA基因突变的高通量联合检测。（1）建立了液滴阵列PCR系统，可同时完成10×10液滴阵列中目的基因的准确扩增。（2）建立了基于酶反应的细胞裂解方法，可实现液滴内细胞裂解和DNA释放，并可连续完成液滴原位的PCR扩增，将细胞裂解与PCR扩增有效衔接。（3）提出了垂直进样的液滴毛细管进样方式，成功实现液滴阵列中多个DNA样品的连续电泳分离，并使PCR扩增/酶切反应与下游的分离检测过程有效衔接。（4）建立了自动化控制系统，首次实现液滴内细胞裂解、PCR扩增、酶切反应、电泳分离过程的整体自动化，使PCR-RFLP基因突变检测过程连续化进行，并可进行多样品的同时分析。采用该系统成功实现大肠癌患者肿瘤组织及血液标本中K-ras、B-raf、PIK3CA基因突变的联合检测。此外，创建了能够检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，为进行K-ras、B-raf、PIK3CA基因的联合检测奠定了基础；将液滴PCR系统扩展应用，初步建立了基于核酸适配体的肿瘤转移特异性外泌体的定量检测方法。本研究所建立的系统具有对小体积样品进行高效、连续分析的能力，不仅适用于基因突变的检测，也为其它DNA相关分析提供了有效的技术平台。