核酸适配子W3识别的外泌体靶标蛋白的鉴定及其在介导大肠癌转移微环境形成中的作用

Metastasis is the leading cause of colorectal cancer related death. The identification of metastatic biomarkers is very important in cancer prognosis and therapy. Recent researches have demonstrated that the nanoscaled exosome secreted by tumor cells can participate in formation of tumor metastatic microenvironment by mediating intercellular communication and might be the potential prognostic factor of tumor metastasis. However, there have been few highly specific exosome markers with definite clinical value. We have previously selected the aptamer W3 that recognized metastatic colon cancer cells in highly specificity by Cell-SELEX. We also found that the target protein of aptamer W3 was secreted into blood circulation in form of exosome and the expression of target protein was significantly correlated with colon cancer metastasis in vitro and in vivo. Thus we assume that the target protein of aptamer W3 might participate in the formation of tumor metastatic microenvionment in form of exosome. In this study, we will identify target protein of aptamer W3 in exosome by mass-spectrometry technology. The interaction between target protein positive exosome with endothelial cells as well as resident cells in metastatic organs which participates in metastatic microenvironment remodeling will be investigate by in vitro, in vivo and mRNA expression profiling assays. The clinical value of target protein involved in the exsome will be evaluated by serological detection methods for the purpose of discovering novel metastatic biomarkers.

转移是大肠癌患者致死的主要原因，发现和鉴定相关标志物对预测和治疗转移具有重要意义。近期研究显示，肿瘤细胞分泌的纳米级膜性囊泡-外泌体可通过介导细胞间的通讯参与肿瘤转移微环境形成，是肿瘤转移的潜在预测因子，但目前仍缺乏具有明确临床价值的特异性外泌体标志物。申请者前期采用Cell-SELEX技术筛选得到能够特异性识别转移性大肠癌细胞的核酸适配子W3，研究发现，W3靶蛋白可以外泌体形式进入患者外周血，体外、动物体内及肿瘤组织标本检测均显示W3靶蛋白表达水平与大肠癌转移特别是远端转移密切相关，由此推测，W3靶蛋白可能以外泌体形式参与肿瘤转移微环境形成。为此，本研究拟采用质谱技术从阳性外泌体中鉴定W3靶蛋白，并通过体内、体外实验及mRNA表达谱分析证实W3靶蛋白阳性外泌体通过与内皮细胞以及转移器官定居细胞的相互作用参与转移微环境重塑。通过血清学检测评价其临床应用价值，以期发现新的肿瘤转移相关标志物。

转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，发现和鉴定相关标志物对预测和治疗转移具有重要意义。外泌体是细胞分泌的纳米级膜性囊泡，可通过将内含物传递给受体细胞参与肿瘤转移，是肿瘤转移的潜在预测因子，但目前仍缺乏具有明确临床价值的特异性外泌体标志物。本研究前期通过Cell-SELEX筛选到能够特异性识别高转移潜能肿瘤细胞的核酸适配体W3，本课题的主要目标是鉴定W3识别的靶标物质，明确靶标物质能够以外泌体形式参与肿瘤转移及微环境形成，以发现特异性外泌体标志物。取得的主要成果是（1）采用质谱技术成功鉴定W3靶标物质，并通过靶标物质的生物化学特性、亚细胞定位及基因表达模式等分析，证实W3靶标物质是分子量为130KD的膜蛋白。（2）研究发现，鉴定的p130蛋白能够以外泌体形式分泌，并通过水平传递至受体细胞参与肿瘤转移及微环境形成。体外及小鼠体内实验显示，来自大肠癌细胞的p130蛋白阳性外泌体可以水平传递磷酸化EGFR至HUVEC内皮细胞，促进血管生成。研究中首次发现外泌体来源的磷酸化EGFR可通过调控HUVEC的IL8分泌，促进管状结构形成。基因敲减及过表达实验显示，来自高转移胃癌细胞的外泌体形式p130蛋白能够进入低转移活性细胞，通过影响M-ras表达促进其迁移和侵袭；来自胃癌细胞的外泌体形式p130蛋白能够进入成纤维细胞，首次发现外泌体形式p130蛋白促进成纤维细胞的迁移。（3）创建了基于微流控液滴阵列系统的核酸适配体PCR扩增方法，实现了对p130阳性外泌体的特异性定量检测。（4）成功构建W3分子信标，首次实现一步操作即可对表达特定标志物的外泌体进行定量检测。（5）对大肠癌患者肿瘤组织中及外周血来源外泌体中p130表达分析显示，p130表达与大肠癌发生、转移及不良预后相关，p130蛋白是判断大肠癌预后的潜在标志物，p130阳性外泌体可能作为大肠癌诊断的液体活检标志物。