基于PASS技术的egfr基因突变比例检测方法的建立及其在NSCLC患者靶向治疗预后评估中的应用研究

Epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation is a positive predictive factor indicating favorable prognosis of non-small cell lung cancer to the targeted therapy of tyrosine kinase inhibitor (TKI). However, there are still some NSCLC patients harboring mutant EGFR gene do not sensitive to EGFR-TKI treatment. Our preliminary researches suggested that the efficiency of TKI therapy might related to the proportion of tumor cells harboring mutant EGFR gene. But this hypothesis is still lack of support. Parallel allele-specific sequencing (PASS) is a new technology for mutant gene detection and mutation proportion assaying, which has not been reported in the field of tumor related researches. In this program, the technology platform of PASS is planned to be constructed and perfected on the basis of our previous studies. Then the tumor tissue samples from NSCLC patients receiving EGFR-TKI therapy are planned to be detected by PASS. The relationship between the efficiency of TKI targeted therapy and the proportion of tumor cells harboring EGFR mutation is planned to be analyzed on the basis of PASS detection and the follow-up study on NSCLC patients. The impacts of commonly used chemotherapy drugs and EGFR-TKI on the proportion of EGFR mutation are also planned to be investigated, by establishing the co-culture system of human NSCLC cell lines harboring wild type and mutant EGFR genes.

表皮生长因子受体(EGFR)基因突变是非小细胞肺癌（NSCLC）患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向治疗预后良好的预测因子。然而仍有部分存在EGFR基因突变的NSCLC患者对EGFR-TKI的治疗不敏感。课题组前期研究提示，TKI治疗的效果可能与肿瘤组织中发生EGFR突变的细胞的比例相关，但这一推测尚缺乏研究支持。平行等位基因特异性序列分析(PASS)技术是近年建立的一种突变基因检测和比例分析的新技术，目前尚未见用于肿瘤相关研究的报道。本项目拟在前期研究基础上系统建立并完善基于PASS技术的EGFR基因突变比例检测的技术平台，然后对接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者的肿瘤组织标本进行检测分析，结合对患者的随访探讨EGFR突变比例与靶向治疗效果的关系，同时通过建立携野生型和突变型EGFR的人NSCLC细胞株的混合培养体系，探讨常用化疗药物及EGFR-TKI对EGFR基因突变比例的影响。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI)是治疗NSCLC的靶向药物，但只有EGFR基因外显子发生了突变的患者才能从该靶向治疗中获益，因此EGFR基因突变已成为NSCLC靶向治疗预后良好的预测因子。然而研究显示，定性检测EGFR基因外显子突变仅能预测部分靶向治疗的效果，有20%~40%检测到EGFR突变的NSCLC患者不能从EGFR-TKI的靶向治疗中获益。有研究提示，EGFR-TKI靶向治疗的效果可能与肿瘤组织中发生EGFR基因突变的细胞的比例相关。本研究首先构建了含野生型和突变型EGFR基因序列的重组质粒，以其为模板建立了可检测突变型EGFR基因比例的等位基因特异性序列分析技术（PASS）平台。研究结果显示，PASS技术可同时用于点突变和缺失突变的检测，其最低可检出的DNA分子为1拷贝，并可从野生型EGFR基因中检出0.01%的突变型基因，而且具有良好的准确性和精密度。在此基础上，我们探讨了吉非替尼和临床常用的化疗药物对EGFR基因突变比例的影响，结果显示：吉非替尼可显著抑制EGFR突变细胞的生长，但对EGFR基因野生型的细胞没有杀伤作用，吉西他滨则对野生型NSCLC细胞具有更好的杀伤作用，顺铂对NSCLC细胞的杀伤作用没有选择性。随后我们探讨了PASS技术检测临床石蜡组织标本中EGFR基因突变比例的性能，结果显示，相较于经典的ARMS技术PASS能更敏感地检出肿瘤组织中的突变型EGFR基因。最后，我们评价了含不同比例突变型EGFR基因的患者对对EGFR-TKI治疗效果的差异，结果显示突变型EGFR基因比例大于30%的患者表现出更好的获益，而突变型EGFR基因比例小于10%的患者均不能为EGFR-TKI的治疗中获益。本研究成功构建了可准确检测突变型EGFR基因比例的PASS技术，并首次证实了突变型EGFR基因的比例对EGFR-TKI治疗效果的影响。