氨基酸残基影响漆酶氧化还原电势的机制研究

Laccase is an important multifunctional oxidase which has broaden potential applications in industry. However, laccases with low redox potential can not oxidize substrates with relatively high redox potential. This drawback highly limits the applications of laccase in industry. Therefore, deciphering the rationales of amino acids governing the structure-function relationship of their redox potential will significantly enhance the research and industrial application of laccase. In this project, we aim to improve the redox potential of a fungal laccase by random mutagenesis with high mutation rate and ultra-high throughput microfluidic screening. Through analysis of the amino acid mutations which specifically influence redox potential and/or enzyme activity using computational tools (homology modeling, molecular dynamic simulation and auto-docking), structure function relationship of redox potential of laccase will be interpreted and concluded. This directs the protein engineering of laccases to acquire high redox potential and high enzyme activity. The discovered general principles will enable engineering redox potential of laccases in a more efficient and rational way.

漆酶是一种重要的多功能氧化酶，具有广阔的工业应用前景。但其较低的氧化还原电势致其不能氧化较高氧化还原电势的底物，严重限制了漆酶的广泛应用。因此，获得具有高氧化还原电势的漆酶并阐明其蛋白结构与氧化还原电势和酶活力之间的结构功能关系将大大推动漆酶的研究与应用。本项目拟通过高突变率的定向进化和超高通量的液滴微流控筛选技术，改造并筛选具有高氧化还原电势、高催化活力的漆酶突变体。通过计算机辅助手段（同源建模、分子动力学模拟、底物对接等）分析分别和同时影响氧化还原电势和酶活力的氨基酸突变位点，从它们的理化性质、位置、二/三级结构、突变类型、氨基酸之间的相互作用等方面系统地分析对氧化还原电势和酶活力的影响机制，得出其结构功能关系的普遍规律，为理性地改造漆酶的氧化还原电势奠定理论基础。

漆酶为一类重要的多功能氧化酶，具有广阔的工业应用前景，如木质素降解、染料脱色、有机污染物降解、生物检测、高分子合成和食品工业等领域。然而，天然来源的漆酶活力比较低，而且难以在工业应用环境下保持稳定，从而限制了漆酶的商业化生产以及用于大规模木质素降解和环境治理等。本项目建立了基于荧光的超高通量液滴微流控筛选系统和96孔板高通量筛选方法，辅助漆酶快速定向进化。通过构建高突变率突变库及筛选，快速获得了12个性能提高的突变体，重组优势突变位点，最终获得一个活性提高1.8倍、稳定性提高12.9倍的突变体。分析优势突变位点，发现除了活性中心，蛋白表面上存在很多影响酶活力和稳定性的氨基酸，需要通过超高通量筛选方法对其进行探索，挖掘可能的位点。通过基因重组，获得一个活性提高2.46倍、氧化还原电势提高35mV的突变体，一个活性提高3倍、稳定性提高7.7倍的重组子。并通过计算机辅助手段（同源建模、分子动力学模拟等）分析了氨基酸残基影响漆酶活性、稳定性的机制，进一步指导漆酶的（半）理性设计。本课题建立的超高通量液滴微流控筛选体系，可以推广至大部分能够直接催化Amplex Red或偶联催化Amplex Red生成荧光的酶，这将加速其他酶的快速进化。本项目通过定向改造的方法获得了活力和稳定性均提高的漆酶突变体，将在木质素降解、有机合成和染料脱色等各应用领域中有更大的应用潜力。