磷酸化位点及其邻近氨基酸残基调控水稻NADH型硝酸还原酶活性的作用机制研究

Phosphorylation is one of the most important post-translational modifications of proteins, which is related to many activities of life. Phosphorylation of nitrate reductase decrease the activity of Nitrate reductase significantly from light to dark, and it affects the assimilation and uptake of the nitrate. However, the regulation mechanism of nitrate reductase activity by phosphorylation is not clear. Our former research work showed that the mutation of phosphorylation sites and its adjacent amino acid residues result in different changes of phosphorylation level and nitrate reductase NIA2 activity in Arabidopsis. In this research, the mechods of Site-directed mutagenesis, Western blot, Real-time PCR and gene transformation technique will be used to analyze the effects of the phosphorylation sites and its adjacent amino acid residues on the phosphorylation level and activity of nitrate reductase NIA1 protein from light to dark，and the uptake and utilization of nitrogen under the drought，salt，extreme temperatures stress. The mechanism of regulation in nitrate reductase by phosphorylation sites and its adjacent amino acid residues will be described in the post-translational modification levels and physiological and biochemical characteristic. These results provide a new idea and method for more efficient use of nitrogen in rice.

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，它参与调控生物体内许多生命活动。硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）由光向暗磷酸化，使得活性显著降低，减少了植株对硝态氮的吸收和同化。然而，水稻硝酸还原酶活性的磷酸化调控机制尚不清楚。我们前期研究工作发现拟南芥硝酸还原酶NIA2由光向暗磷酸化水平和活性受磷酸化位点及其邻近氨基酸残基的影响。本项目拟利用基因定点突变、Western blot、实时荧光定量PCR、转基因表达等技术研究磷酸化位点及邻近氨基酸残基对水稻硝酸还原酶NIA1由光向暗磷酸化水平与活性的变化，以及其在干旱、盐胁迫、极端温度等逆境条件下对氮素吸收利用的影响，从翻译后修饰水平及生理生化特性方面揭示磷酸化位点及邻近氨基酸残基调控水稻硝酸还原酶活性的作用机制，为水稻高效利用氮素提供新的思路与方法。

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，参与调控生物体内许多生命活动。硝酸还原酶（Nitrate reductase, NR）由光向暗磷酸化，使得活性显著降低，减少了植株对硝态氮的吸收和同化。该研究利用基因定点突变、Western blot、实时荧光定量PCR、转基因表达等技术对磷酸化位点及邻近氨基酸序列对水稻NR由光向暗磷酸化水平与活性的变化，以及低温和不同形态氮素处理等条件下对硝态氮利用的影响进行分析，从翻译后修饰水平及生理生化方面，揭示了磷酸化位点及邻近氨基酸序列调控水稻NR活性的作用机制，为水稻高效利用氮素的提供理论依据。主要结果如下：.（1）克隆了水稻OsNia1基因，明确了NIA1蛋白活性调控的磷酸化位点，构建了NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基定向突变转基因株系。.（2）对NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基定向突变株系NR活性和氮素利用进行分析，表明转录水平调控对NR活性和氮素利用的影响较小，NIA1蛋白的磷酸化修饰是调控NIA1蛋白活性的重要方式。.（3）对常温和低温条件下供试材料的表型、NR活性、硝态氮代谢和活性氧代谢等生理指标进行分析，发现常温处理时NIA1磷酸化位点定向突变株系和OsNia1过表达株系生长受阻，是由于NR活性的提高导致硝酸盐的同化速率加快，亚硝酸盐过量积累对叶片的毒害作用；低温胁迫下NIA1磷酸化位点定向突变株系的NR活性相对较高，对硝态氮的利用增强，亚硝酸盐的积累减少，同时为水稻提供了更多的氮素营养，NIA1磷酸化位点定向突变株系的耐冷性增强。.（4）对不同形态氮素施用下供试材料的表型、NR活性、硝态氮代谢和活性氧代谢等生理指标进行分析，发现在铵硝混合营养下，亚硝酸盐过量积累是造成NIA1磷酸化位点定向突变株系长势较弱的原因；以硝态氮作为氮源，由于水稻幼苗叶片中铵态氮亏缺，整个硝酸盐的同化途径处于活跃状态，NIA1磷酸化位点定向突变株系过量产生的亚硝酸盐被快速还原，提供了水稻生长所需的氮源，长势优于野生型和其他株系，表明NIA1磷酸化位点的定向突变能够增强水稻对铵态氮亏缺的耐受能力。