线粒体-内质网结构偶联在高迁移率族蛋白B1对T细胞免疫调控机制中的作用研究

High mobility group protein B1 (HMGB1) could act as an important immune modulator by regulating immune cells function. Mitochondria-associated ER membrane (MAM) is the interacting platform of mitochondria and endoplasmic reticulum (ER). It is closely related to endoplasmic reticulum stress (ERS) and cell apoptosis. Our previous study found that one of MAM important physical connection proteins - mitofusin 2 (Mfn2) - plays an important role in the active process of T cell immune induced by HMGB1. This project intends to explore the significance of physical or functional abnormality of MAM as well as signal transduction between ER and MAM in immunomodulation of HMGB1 on CD4+T. CD4+T cell will be stimulated with certain concentration of recombinant HMGB-1. And with the genetic regulation of Mfn2 expression in CD4+T, as well as treatment with chemicals to induce or inhibit ERS response, the significant roles of MAM in the molecular regulation mechanism of HMGB-1 on T cells immune function, and the internal connection of MAM with the ERS pathway of PERK/eIF-2 alpha /ATF4/ will be analyzed. Based on this project, we hope to explore the impact and mechanism of MAM on T cell activation induced by HMGB1. Our findings will help to clarify the understanding of HMGB1 as an immune regulator, thus shed a light to the development of novel therapeutic strategies and targets for the immune regulation for improving the clinical outcome of patients with severe injury and subsequent sepsis.

高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为重要免疫调节分子参与机体免疫反应过程。线粒体-内质网结构偶联(MAM)是线粒体和内质网(ER)发生交互作用的平台，与内质网应ERS和细胞凋亡密切相关。我们前期研究发现MAM重要物理联结蛋白-线粒体融合蛋白2(Mfn2)在HMGB1调控T细胞免疫活化过程中具有重要作用，本项目拟在细胞和整体水平上进一步探讨MAM结构功能异常及其与ER间信息交流对HMGB1介导CD4+ T细胞免疫反应的影响。通过基因调控技术改变Mfn2表达水平，观察细胞和烧伤动物模型中MAM功能结构异常对HMGB1调控CD4+T细胞免疫效应的影响；应用ERS诱导剂以及对PERK/eIF-2α通路相关分子进行干预，论证MAM在HMGB1对T淋巴细胞免疫调控过程中的关键环节与意义。该研究从新的角度深化对HMGB1介导T细胞免疫功能紊乱的认识，从而为烧伤脓毒症的免疫调节治疗提供理论基础和靶点。

线粒体融合蛋白2（Mfn2）是线粒体-内质网结构偶联（MAM）重要的物理结合蛋白，与内质网应激（ERS）和细胞凋亡密切相关。本研究探讨在重要的免疫调节分子高迁移率组蛋白B1（HMGB1）的刺激下ERS改变与MAM结构功能变化的关系及其在HMGB1影响CD4+T细胞的免疫功能状态及凋亡中的地位及作用，对于从新的视角深入认识烧伤脓毒症的发病过程具有重要理论意义和潜在应用价值。主要研究结果如下： 1）在低浓度HMGB1刺激下，正常小鼠CD4+T细胞给予salubrinal (eIF-2α去磷酸化抑制剂) 处理后细胞增殖能力降低。采用ERS特异性诱导剂衣霉素(TM)刺激正常小鼠CD4+T细胞，Mfn2表达明显上调，进一步实验发现，salubrinal明显缓解HMGB1刺激所致的ERS反应，表现为GRP78、CHOP的表达水平明显下降，而Mfn2的表达水平则出现升高趋势；2）HMGB1体外刺激转染过表达Mfn2病毒载体的Jurkat细胞后，分别给予GSK2656157（PERK磷酸化抑制剂）及salubrinal干预，过表达Mfn2的细胞IFN-γ和IL-4水平（Th1/Th2平衡状态）以及IL-2相对表达水平明显升高，GRP78、PERK蛋白表达及磷酸化水平、eIF2α、ATF4、CHOP的蛋白表达水平明显减低，而细胞凋亡无显著的变化；3）采用激光共聚焦显微镜观察发现，与正常组相比应用PERK抑制剂刺激后内质网-Mfn2-线粒体三者共定位减少，且转染慢病毒后细胞状态相对较差，与未转染组相比内质网-Mfn2-线粒体三者共定位有所增加（P<0.05）；4）构建小鼠严重烧伤延迟复苏模型，与实验组比较静脉注射抗HMGB-1抗体治疗组动物生存率明显提高，CD4+T细胞增殖率及IL-2表达水平提高，细胞凋亡率降低，Mfn2表达升高及GRP78、ATF4、CHOP的蛋白以及PERK和eIF2α磷酸化水平下降，内质网-Mfn2-线粒体三者共定位进一步减少。由此说明，HMGB-1表达水平影响着内质网-Mfn2-线粒体的共定位，进一步影响T细胞的免疫功能。